革兰氏阳性菌感染对甘蔗光合作用的影响(2)

　　2结果与分析

　　2.1病原菌的菌落与鉴定

　　28℃恒温培养15~20d后，培养基表面有细小的菌落长出。菌落圆形、无色透明、边缘整齐且中间隆起，直径0.1~0.3mm.再生长2周后，菌落颜色略显乳白色，菌落直径也稍增大，可达0.5mm.

　　用数码照相机对菌落进行拍照（图1-A,B）。随机挑取5个菌落进行PCR[19]检测，待测菌落均能扩增出与正对照一致的目的条带（图1-C）。对目的条带进行胶回收，连接到pM18-T载体后转入大肠杆菌中表达，经双向测序 测得片段大小为438bp,与Genbank数 据 库 中Lxx的 相 应 区 段 序 列（AE016822、AF034641、DQ232616.2）比对，同源性均为100%,故可确认为RSD病原菌。

　　2.2病原菌的形态特征

　　从扫描电镜和透射电镜观察的结果可知，Lxx菌体表面光滑，无鞭毛，菌体有多种形态，多数呈棒形，有的具不同程度弯曲，有的一端或中部略微膨大，少 数 呈 “V”形，大 小 为 （0.16~0.32）μm×（1.1~3.2）μm,并可见部分细胞内有简体与隔膜存在（图2-A,B,C）。

　　Lxx的超薄切片显示其细胞壁光滑，细胞质分布不均，内有电子透明物、电子稠密物，可观察到隔膜将细胞分隔（图2-D）。

　　从图2-E可见蔗茎维管束横切面上2个大而圆的后生木质部导管（M），初生木质部导管（P）在后生木质部导管中间，气腔（L）靠近初生木质部导管，另外还可见韧皮部（Ph）和纤维细胞（Vf）存在于导管周围。

　　从图2-F可见蔗茎3种导管，分别为网纹导管（Rv）、环纹导管（Av）和螺纹导管（Scv）。从图2-G可见蔗茎螺纹导管纵切面的纹孔中观察到Lxx菌体，与用电镜观察纯菌体时所得形态相一致，其大小相近。在导管内的纹孔及导管壁上可见许多圆形颗粒状物质粘附（图2-H），但在健康蔗茎导管内未见Lxx菌体及颗粒状物质。

　　2.3病原菌侵染对甘蔗光合作用的影响

　　由图3可知，GT11和Badila感染RSD蔗株的净光合速率均低于对照。

　　GT11接菌处理120、150、180、210d后分别比对照降低了13.13%、21.66%、21.87%、20.64%,且差异均极显着。

　　Badila接菌处理120、150、180、210 d后 分 别 比 对 照 降 低 了13.49%、13.19%、22.23%、9.88%,且 接 菌 处 理120d和180d的差异极显着，接菌处理150d和210d的差异显着。

　　RSD对 甘 蔗 气 孔 导 度 的 影 响，在GT11和Badila上 均 表 现 为 接 菌 处 理 低 于 对 照 处 理 的。

　　GT11接菌处理在120、150、180、210d分别比对照降低了15.21%、38.72%、40.58%、31.99%,在120d时差异显着，且后3个时期差异均极显着。

　　Badila接菌处理在各时期均低于对照，在120d和180d时分别降低32.72%和35.24%,且差异极显着；在150d和210d时降低虽不显着，但也分别降低了13.41%和18.21%.

　　GT11接菌处理的胞间CO2除120d外，其余各时期均低于对照，在150d和180d时差异极显着，到210d时 差 异 不 显 着，但 低 于 对 照13.53%.

　　Badila接菌处理在各时期均低于对照，但只在120d时差异极显着，其余各时期差异均不显着。

　　在蒸腾速率方面，GT11接菌处理各时期均低于对照，且差异均极显着。

　　Badila接菌处理在各时期也都低于对照，除在150d时差异不显着外，其余时期均达显着水平。这表明GT11和Badila接菌处理的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率在各时期均低于对照处理。

　　3讨论

　　RSD病原菌体外培养不容易成功，是因为其自身缺失编码L-半胱氨酸和甲硫氨酸等关键基因[12],而且生长期间需要极其丰富的营养成分，这与其基因组内含有大量的假基因有关。

　　Lxx基因组内有310个假基因，占全部基因的11.6%[6],且该菌生长十分缓慢，生长周期长，一般需4周左右[2],因此，与其他菌竞争力很弱，一旦分离培养成功即可得到纯菌落。本试验在培养15~20d后有菌落长出，可能是因为改良后的培养基更适于Lxx的生长，或因寄主甘蔗来自于不同品种且生长环境不同。来源于同品种不同植株的原蔗汁接种时，有时菌落数很少，可能与蔗株本身带菌量很少有关。

　　本试验获得的菌落与Davis等[2]和陈健文等[13]描述 的 一 致，但 在 菌 体 形 态 上 略 有 不 同。

　　Davis等[2]、Kao等[14-15]和Liao等[12]在观察RSD病原菌形态时，发现其有分支细丝存在，但本试验中无论是菌体纯培养物观察还是蔗茎超微结构观察时，均没发现Lxx有分支细丝。这可能是试验甘蔗品种不同及其所生长的环境不同所致，或可能是不同的生理 小 种 所 致。

　　Leifsonia xyli subsp.cynodontis（Lxc）是一种引起狗牙根草丛枝、矮化症状的病原菌，Lxx与其在形态学和超微结构上不能区分，但可根据菌落差异进行区分。

　　Lxc菌落黄色，直径可达0.5~1.0mm,比Lxx菌落大许多，也是圆形、边缘整齐，也能在SC培养基上生长，且比Lxx容易培养，生长速度更快[2,16-17].本试验得到的菌落是从甘蔗体内分离且是无色的，故可断定不是Lxc.本试验还观察到RSD病原菌寄居在甘蔗木质部导管中，菌体填充着纹孔，感病蔗茎木质部导管纹孔中及壁上都粘附着许多圆形颗粒状物质。随着甘蔗的不断生长，菌体及圆形颗粒状物质不断增多，势必会因大量的菌体或菌体分泌物填充在导管内，而使甘蔗对水分和无机盐的运输能力降低，阻碍甘蔗的生长，导致其出现矮化症状。

　　陈明辉等[8]观察RSD病原菌侵染甘蔗后发现株高下降，茎径变小、节间变短，感病叶片的叶绿体变形、基粒结构消失，叶绿体外膜和内膜剥离，推测其叶片的光合作用下降。本试验中GT11和Badila感染RSD后，Pn、Gs、Ci和Tr均低于健康蔗株，证实了陈明辉等[9]的推测，并可推断感病甘蔗光合能力下降主要是由非气孔因素引起的。于力等[17]在研究黄花曲叶病毒对番茄叶片光合特性的影响时也发现光合作用光反应场所受到破坏，净光合速率下降。

　　Zhao等[18]观察甘蔗锈病侵染甘蔗后也发现叶片Pn、Gs和Tr均有所下降，其原因由非气孔因素引起。本试验中发现感病蔗茎受病原菌和圆形颗粒状物质堵塞，说明蔗株的生长不良也有可能影响气孔的发育，进而使光合作用降低。改良的MSC培养基适用于RSD病原菌的分离培养，感染RSD蔗茎木质部导管被病原菌和圆形颗粒状物质堵塞，且RSD可降低甘蔗的光合作用。

　　参考文献

　　[1] 张荣跃，黄应昆，李文凤，等。甘蔗主栽品种宿根矮化病调查及病原检测[J].中国糖料，2014（2）：26-27.

　　[2]DAVIS M J,GILLASPIA A G,HARRIS R W,et al.Ratoonstunting disease of sugarcane:isolation of the causal bacterium[J].Science,1980,210:1365-1367.

　　[3]EVTUSHENKO L,DOROFEEVA L,SUBBOTIN J,et al.Le-ifsonia poae,gen.nov.,sp.nov.,isolated from nematode gallson Poa annua,and reclassification of Corynebacterium aquatic-um Leifson 1962as Leifsonia aquatic（ex Leifson 1962）gen.nov.,nom.rev.,comb.nov.and Clavibacter xyli Davis et al.1984with two subspecies as Leifsonia xyli（Davis et al.1984）gen.nov.,comb.nov[J].International Journal of Systematicand Evolutional Microbiology,2000,50:371-380.

　　[4] 陈明辉，杨丽涛，谢晓娜，等。甘蔗宿根矮化病研究进展[J].南方农业学报，2011,42（3）：280-283.