革兰氏阳性菌感染对甘蔗光合作用的影响

　　甘 蔗 宿 根 矮 化 病 （ratoon stunting disease,RSD）是世界甘蔗种植国家普遍发生的一种病害。甘蔗是广西重要的经济作物，广西和云南甘蔗主栽品种RSD发 病 率 高，阳 性 检 出 率 达59.64%[1].RSD是由Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）引起，主要寄居在维管束木质部导管内，属革兰氏阳性菌[2].Davis等[2]首先实现了Lxx的体外分离培养，并命名为Clavibacter xyli subsp.xyli（Cxx）。Evtushenko等[3]根据rRNA和基因组内高G+C含量等特点，将其更名为Leifsonia xyli subsp.xy-li（Lxx）。适 合Lxx体 外 培 养 的 培 养 基 有SC、SCM、DM和S8等[4].Brumbley等[5]对SC培养基进行改良获得MSC培养基，优化了单菌落生长条件。Monteiro-Vitorello等[6]以Lxx纯培养物或感染RSD甘蔗为材料，完成了宿根矮化病原菌的基因组测序，发现果胶酶基因、纤维素酶基因和ABA合成基因可能是Lxx的致病基因；Young等[7]分析了来自澳大利亚、印度尼西亚、日本、美国等9个国家Lxx的16SRNA后，发现序列间没有差异；陈明辉等[8-9]研究发现甘蔗感染RSD后体内赤霉素和生长素明显降低，脱落酸明显升高，株高、茎径、节间长度和单茎重也明显降低。

　　甘蔗的光合作用与产量有密切联系，而RSD可导 致 甘 蔗 产 量 下 降5% ~30%,严 重 时 可 达60%[10],因此，研究RSD感染对甘蔗光合作用影响有重要意义。但因Lxx很难进行体外分离培养，使得研究RSD病原菌的致病机制及其与甘蔗寄主间的互作机制受到限制，关于Lxx侵染对甘蔗光合作用的影响也未见报道。本试验以感染RSD的甘蔗品种Badila为材料，观察Lxx在蔗茎内的定殖情况，进行体外分离培养Lxx后，接种到甘蔗品种桂糖11号（GT11）和Badila健康甘蔗种茎上，并以不接菌为对照，分析不同时期甘蔗光合作用的变化，旨在研究Lxx的侵染特性和RSD胁迫对甘蔗光合作用的影响，为进一步探讨Lxx与寄主互作机制提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1病原菌的分离与培养

　　选取疑似感病果蔗（Badila），采用PCR检测是否感染RSD[11].确认带病后砍取感病蔗茎基部，除掉杂质和蜡粉，自来水冲洗干净后用去离子水冲洗2遍并喷洒酒精，在酒精灯火焰上快速消毒后去皮，切成5cm长的小段，放入灭菌的50mL离心管内，于3 500r/min室温下离心15min.收集离心管底部蔗汁，用 定 量 中 速 滤 纸 初 步 过 滤，再 过 孔 径0.45μm滤膜，把过滤除菌的蔗汁接种在MSC培养基上。待菌液完全被吸收后用封口膜封好，倒置于28℃恒温培养箱中培养。培养基配方参照Brumb-ley等[5],略加修改。培养基配方（1L）：高压灭菌组分包括Corn meal agar 17g,Bacto-agar 4g,Bacto-peptone 8g,Bovine hemin chloride（0.1%solution in0.05mol/L NaOH）30mL,MgSO40.2g,K2HPO4（0.1mol/L）13mL,KH2PO4（0.1mol/L）87mL,加去离子水至900mL,并用10mol/L NaOH调至pH7.5;过滤除菌组分包括Glucose 2g,Cysteine,freebase 0.5g,Bovine serum albumin,fraction V 2g,加去离子水至100mL,过孔径0.22μm滤膜后加入高压灭菌成分中并轻摇混匀。

　　1.2电镜样品的制备

　　扫描电镜样品制备：取PCR检测带菌蔗茎基部切成5mm×5mm小块，放入3%戊二醛中固定2h以上，PBS缓冲液清洗3次，50%、70%、80%、90%、100%乙醇依次脱水，六甲基二硅胺烷洗3次后抽真空，粘座，IB3离子溅射仪喷镀后用Tescan Vega 3扫描电镜观察并拍照。

　　透射电镜超薄切片制备：将收集到的菌液8 000r/min,离心5min成菌团，弃掉PBS上清液，换用ddH2O,同样的方法冲洗菌团2遍后，立即加入3%戊二醛固定过夜。固定后于0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次15min,在1%锇酸中固定1~2h,然后用乙醇-丙酮逐级脱水：50%、70%、80%、90%乙醇、1/1混合液（90%乙醇/90%丙酮）、90%丙酮、3次100%丙酮（各级每次15min）。浸透：丙酮/包埋剂=1/1渗透1h,（1/3）渗透1~3h或过夜，最后纯包埋剂全浸透2h.再用纯包埋剂（环氧树脂618）包埋，并按35℃/5h、45℃/12h、60℃/24h聚合后修块，用徕卡UC7超薄切片机切片，经醋酸铀-柠檬酸铅双重染色后，用日立H-7650型电子显微镜观察、拍照。

　　透射电镜负染样品制备：用0.01mol/L的PBS把已培养15~20d且长势良好的菌落从培养基表面冲洗下来，收集于灭菌的1.5mL离心管中。取1滴Lxx菌悬液于铜网上，用1%磷钨酸染色2~5min,晾干后置于透射电镜上观察。

　　1.3接菌试验

　　选取种植在广西大学农学院温室大棚内的甘蔗品种桂糖11号（GT11）和果蔗（Badila）作为试验材料。用PCR检测生长长势良好、无病虫害的蔗株，确认不带病后砍成单芽段，经50℃温汤脱菌2h,获得无病种茎。在单芽段两个切面上接种108cfu/mL的菌液300μL,分接菌处理和接种0.1mol/L PBS的对照处理，28℃催芽2d.于2014年1月21日沙培育苗，待 其长至3叶期时移栽营养桶（直 径300mm,高350mm）内土培。每处理6桶，每桶3株。土壤经过阳光暴晒3d,每桶土20kg.土壤养分，N/P/K比例为86.67/31.00/129.33.待其长至6~7叶时，PCR再次检测，确定侵染蔗株感染上RSD.

　　随机选取接菌处理中确认感染RSD的蔗株和对照处理蔗株各6株，分别在接菌后120、150、180、210d,用LI-6400XT光合仪在晴朗的上午9:00~11:00测 定+1叶 净 光 合 速 率 （Pn）、气 孔 导 度（Cond）、胞间CO2（Ci）和蒸腾速率（Tr），温度和湿度均为环境 水平，人工光 源，光量子通量密度为1 500μmol/（m2·s）。

　　1.4数据分析

　　使用SPSS 15.0软件和Excel 2007对试验数据进行统计分析。