石斛属（Dendrobium spp.）是兰科植物的第二大属，目前该属在全世界共发现 1100 多种，在我国有 76 个种和 2 个变种。其中，石斛属药用植物金钗石斛（D. nobile Lindl）是传统名贵中药，被我国历版药典所收录，以其干燥或新鲜的茎入药，具有滋阴清热、益胃生津之功效。由于近年来石斛属药用植物被过度挖掘，野生资源濒临枯竭，石斛属药用植物已被国家列为一级保护植物名录。
随着人们对石斛中药材需求量的逐渐增加，目前药用石斛属植物人工栽培的面积不断扩大。然而，随之而来的各种病害不断出现，严重阻碍了人工栽培的进一步发展，并给种植户带来了巨大的经济损失。有研究表明，钟器腐霉曾在云南省导致大规模鼓槌石斛、球花石斛、线叶石斛茎部的腐烂。在以往的研究中，我们鉴定出金钗石斛软腐病的病原真菌为终极腐霉。
为深入研究软腐病病原菌终极腐霉的致病机理，探讨其在导致金钗石斛软腐病病害过程中的机制，金钗石斛的根、茎和叶等部位发生的显微、超微结构变化以及病原菌在植物体内的分布和侵染情况，本研究采用水压片法以及扫描电镜观察法分别对接种终极腐霉病原菌前后金钗石斛苗的根、茎和叶的结构变化进行观察，为深入理解病原菌的侵染过程，揭示其形态学特征和侵染机制，以及为更好预防和控制此病害的发生发展提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
金钗石斛组培苗为本实验室保存。
1.1.2 主要仪器
ZEISS Axio Imager A1 型光学显微镜购自德国蔡司公司；JSM-6510 LV 型扫描电子显微镜购自日本电子株式会社。
1.2 方法
1.2.1 病原菌
终极腐霉对金钗石斛的致病性试验 将刚出瓶的生长一致的株高 4 ~ 6 cm 的新鲜金钗石斛组培苗预先栽种在装有灭菌的栗树皮基质的塑料花盆内，每个花盆栽种 3 株组培苗。病原菌为金钗石斛发病植株上分离得到的终极腐霉。
采用孢子喷洒叶片的方法进行致病性试验，接种的病原菌为孢子悬浮液（1 × 106个/ml），均匀地喷洒于金钗石斛幼苗的叶片上。对照组喷洒无菌水。
致病组和对照组均设 30 个重复。接种后置于 20 ~25 ℃ 温室塑料膜保湿培养 48 h，然后揭去塑料膜，每天观察植株发病情况。
1.2.2 常规水压片法进行光镜观察
取 1 滴10% KOH 溶液滴加到载玻片上，然后取健康的和发病 48 h 的金钗石斛的叶片作为观察对象，徒手切片法切取尽量薄的叶片组织，浸入 KOH 溶液中装片，光学显微镜下观察、照相。
1.2.3 扫描电镜样品的制备流程
取健康的以及发病 48 h 的金钗石斛的根、茎、叶等部位，用于制作扫描电镜样品，样品的处理按文献[8]进行：
2.5% 戊二醛室温下固定 4 ~ 6 h 后，以 PBS（pH6.8，0.1 mol/L）洗涤 3 次，每次 30 min；分别经30%、50%、70%、80%、90% 以及 100% 丙酮梯度脱水，每个梯度 3 次，每次 30 min；再经纯醋酸异戊酯置换 3 次，每次 30 min；经 CO2临界点干燥、粘样，再经过金离子喷溅，最后于扫描电子显微镜下观察、拍照。
2 结果
2.1 光学显微镜观察
致病前后金钗石斛叶片显微结构的变化在光学显微镜下，正常的叶肉细胞细胞壁较厚，排列规则，叶绿体分布于细胞的周边（图 1A），而发病的叶肉细胞壁变薄，细胞完整性受到破坏，叶绿体分散、零乱（图 1B，C）。终极腐霉病原菌在金钗石斛叶片内大量存在，菌丝生长旺盛，直径可达 11 μm，菌丝体内充满泡囊（图 1C 黑色箭头所示），且具有流动性，这与终极腐霉有关的形态描述相一致。大量的卵孢子和孢子囊分布在叶肉细胞间或内部，卵孢子壁厚 2 ~ 3 μm（图 1B）。
2.2 扫描电子显微镜观察
致病前后金钗石斛根、茎、叶结构变化。
2.2.1 金钗石斛植株被病原菌侵染前后的根表面和横切面显微结构 由图 2 可以看出，未被病原菌侵染的金钗石斛植株根的表面结构保持完整（图2A），根被细胞显示出典型的网状纤维样结构，皮层细胞结构较完整，其体积明显比根被细胞大，有较多颗粒样物质（图 2B 上箭头），推测为淀粉粒样的结构，根的中柱髓部（图 2B 下箭头）结构也较完整，细胞排列规则。被病原菌侵染的金钗石斛植株根的表面分布有大量的病原菌终极腐霉的菌丝（图 2C 箭头），病原菌菌丝体穿过根被死亡细胞表面的各种孔洞，在根部蔓延和穿行，交织成网状，进而深入根皮层细胞，破坏皮层细胞的细胞壁而导致细胞的坏死（图 2C，D），终极腐霉高密度分布是宿主植物发病的基础，同时说明这种土传植物病害病原菌终极腐霉首先必须在基质中侵入根部组织进而侵染其他组织导致植株的发病和死亡，这为我们提供了终极腐霉侵染植株直观的显微依据。
2.2.2 金钗石斛植株被病原菌侵染前后的茎表面显微结构 由图 3 可以看出，未被病原菌侵染的金钗石斛植株茎表面保持完整的结构，茎叶鞘部位细胞纵向分布，排列极其规则，散在分布有气孔样结构（图 3A）。金钗石斛植株受到病原菌侵染后，终极腐霉菌丝大量在茎表面穿行（图 3B 白色箭头)、纵横交错，使该部位的结构完整性受到严重破坏，茎表面出现了大大小小的孔洞；金钗石斛茎表面的终极腐霉菌丝产生分支（图 3B 黑色*）后，通过机械穿透作用进入组织内部（图 3B 白色*），后又穿行暴露于茎表面（图 3B 黑色**）；终极腐霉菌丝出现不规则膨大，形成附着胞，并牢牢地黏附在茎表面（图 3B 黑色箭头)，并将继续侵染植株的深部组织。
2.2.3 金钗石斛植株被病原菌侵染的叶背面和横切面显微结构 图 4A 显示未被病原菌侵染的金钗石斛植株叶部的完整结构，横切面可以看到完整的维管束结构。图 4B 显示许多终极腐霉菌丝末端膨大，纵横排列，形成类似吸盘的特殊结构（图 4B黑色箭头），牢固地附着于叶背面，从多个角度和部位黏附、侵染叶背面。图 4C 显示大量病原菌菌丝从气孔处争相侵入寄主体内。图 4D 显示终极腐霉菌丝在气孔处发生断裂后，可见许多泡囊结构，这是终极腐霉的典型特征之一。
2.2.4 金钗石斛植株被病原菌终极腐霉侵染的叶表面形态结构 由图 5 可以看出，叶表面分布的病原菌菌丝体中间出现膨大形成典型的孢子囊结构（图 5A 黑色箭头）。图 5B 示藏精器（黑色箭头）和藏卵器（白色箭头）的结构，它们是终极腐霉病原菌的有性繁殖器官，核配以后形成卵孢子进而产生下一代病原菌菌丝体。图 5C 示菌丝侧生的孢子囊结构，此孢子囊结构也称为厚垣孢子，其具有抵抗恶劣或极端环境的能力。
3 讨论
病原菌终极腐霉是全球性的重要植物病原菌，可引起多种农作物和经济作物的病害，给国家造成巨大的经济损失。终极腐霉侵染石斛属植物的现象越来越普遍，目前国内外对终极腐霉的致病机制报道较少，侵染寄主的具体过程尚不明确，给该病原菌导致的病害的防治带来了极大困难。以往的研究表明，终极腐霉能够产生多种蛋白以及纤维素酶、同工酶等细胞壁降解酶，导致细胞壁的降解，从而引起胡萝卜空斑症的发生。本研究系统地研究了终极腐霉感染金钗石斛前后的形态学变化，由徒手切片以及扫描电镜观察推测，终极腐霉主要通过表皮、气孔等结构进行机械穿透、形成附着胞以及类似吸盘等特殊形态结构并分泌降解酶破坏金钗石斛细胞的细胞壁及其内部结构，并在细胞间延伸侵染，使根、茎、叶组织严重破坏，进而蔓延发病。
植物病原菌侵染寄主是一个极其复杂的过程，在今后的研究中，利用胶体金标记技术及荧光标记技术系统地进行终极腐霉对金钗石斛不同器官致病性的细胞化学研究，以及深入探讨终极腐霉与金钗石斛相互作用的分子机制，不仅有利于终极腐霉致病机制的揭示，同时为开发有效的真菌抑制剂提供重要的理论基础。
