第二章 一起地方绵羊痘的实验室诊断
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源
辽宁锦州地区送检疑似绵羊痘病羊。
1.1.2 主要试剂
多聚甲醛、苏木素染液、伊红染液、无水乙醇、石蜡（熔点分别为 54℃和56℃）、二甲苯等均为国产分析纯试剂。
1.1.3 主要仪器
医用手术器械；BS124S 型电子分析天平（赛多利斯仪器北京有限公司）；生物显微镜（OLYMPUS，日本）；倒置相差显微镜（OLYMPUS，日本）；显微成像系统（Motic BA200）；RM2016 组织切片机（Leica，德国）；数码照相机（Canon）等。
1.2 方法
1.2.1 主要溶液配制
1.2.1.1 磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2）一次将 Na2HPO4·12H2O 3.582 g，KH2PO40.272 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g 加入到 900mL 去离子水中，磁力搅拌器进行加热搅拌使其充分溶解，用 1M NaoH调节溶液 pH 值至 7.2，补加去离子水至 1L，高压灭菌后 4℃保存。
1.2.1.2 4%多聚甲醛固定液
使用天平称量 40g 多聚甲醛放入 500mLPBS（0.01M,pH 7.2）中，加热至 55℃使其充分溶解，随后向其中 1MNaOH 至溶液清晰，冷却，冷却后加入 PBS 溶液定容至 1L。
1.2.1.3 伊红染液
称取伊红 1g，加入到 100mL75%乙醇溶液中，在加入的同时进行搅拌至彻底溶解，之后加入几滴冰醋酸，至溶液清亮即可。
1.2.1.4 苏木素染液
称取苏木精 1g，碘化钠 0.2g，硫酸铝钾 50g 加入到 1L 蒸馏水中，加热溶解后加入枸橼酸钠 1g，水合氯醛 50g，搅拌使其溶解。
1.2.2 流行情况
询问畜主，了解该病在送检病羊所在羊群中的发生情况、有无既往病史以及附近地区有无该病疫情的发生。
1.2.3 病理剖检
对送检病死羊进行常规病理剖检，观察并记录皮肤、气管、肺脏、口腔、肾脏、胃及肠黏膜等组织脏器的病变情况，检查淋巴结有无肿大等。分别采集皮肤、气管、肺脏、口腔、肾脏、胃及肠黏膜等组织脏器，一部分置于中性福尔马林溶液中固定进行病理组织学检查，另一部分置于-20℃保存备用。
1.2.4 病理形态学观察
1.2.4.1 病理切片的制作
1.2.4.1.1 固定
将采集的病死羊各脏器组织整修成切面平整适当大小的组织块，置于中性福尔马林溶液中进行固定 3d 以上。
1.2.4.1.2 冲洗
固定结束后，为了去除组织块内残存的中性福尔马林，先用流水冲洗组织块，再将组织块置于 0.01MPBS（pH 7.2）溶液中浸泡 3d 以上，间或换液。
1.2.4.1.3 脱水
冲洗后的组织块需进行脱水：70%（24h）→80%（2h）→90%乙醇（2h）→95%乙醇（3h）→100%乙醇（1 h）→100%乙醇（1 h）。
1.2.4.1.4 透明
脱水后将样本经下列溶液进行透明处理：二甲苯：二甲苯：无水乙醇（1:1，V/V）（30 min）→二甲苯Ⅰ（20 min）→二甲苯Ⅱ（20 min）。
1.2.4.1.5 浸蜡
将透明后的组织块置于温箱内按以下步骤进行浸蜡：蜡杯Ⅰ（54 ℃熔点）（0.5h）→蜡杯Ⅱ（54 ℃熔点）（0.5 h）→蜡杯Ⅲ（56 ℃熔点）（1 h）。
1.2.4.1.6 包埋
组织浸蜡后置于包埋盒内，使用蜡杯 III 内的石蜡进行包埋，待表面石蜡稍凝固后，迅速放入水中，使其快速凝固。
1.2.4.1.7 切片、展片
包埋好的组织块进行修块，随后连续切片，厚度为 4 ?m。每个组织块取其完整的切片放于 39℃水浴锅中进行展片，展开后用处理过的载玻片捞取，自然风干后置于 4℃冰箱备用。
1.2.4.1.8 H.E.染色
①脱蜡：二甲苯 I（20min）→二甲苯Ⅱ（20 min）→无水乙醇（1～3 min）→95％乙醇（1 min）→90％乙醇（2 min）→80％乙醇（2 min）→70％乙醇（2 min）→蒸馏水洗（3 min）;②染色：苏木素染液（5～7 min）→自来水蓝化（15 min）→0.5%盐酸酒精分化（15～30 s）→自来水洗（3 min）→蒸馏水（1 min）→95％乙醇（1 min）→伊红染液（1～2 min）;③脱水、透明和封片：95％乙醇（1 min）→95％乙醇（1 min）→无水乙醇（1 min）→重复无水乙醇（1 min）→二甲苯：无水乙醇（1:1，V/V）（1 min）→二甲苯Ⅰ（5～10 min）→二甲苯Ⅱ（5～10 min）→中性树胶封片。
1.2.4.2 病理组织学观察
分别对病死羊肺、唇、皮肤、胃、脾、肾等病理切片进行检查，观察其有无出现病毒包涵体等羊痘特征性的病理变化。
1.2.5 实验室诊断
1.2.5.1 细菌学检查
无菌采集病死羊的血液、肝脏、脾脏以及皮肤痘疹做病料触片和涂片，并进行细菌的分离培养，经革兰氏染色和美兰染色镜检。
1.2.5.2 电镜负染观察
将病羊痂皮研磨液反复冻融 3 次后，3000r/min 离心 20min，取上清液，经2%磷钨酸负染后进行电镜观察。
1.2.5.3 病料处理
将采集到的病羊的皮肤组织痂皮剪碎，用石英砂充分研磨，按照 1:5 的比例稀释于 0.01mol/PBS 缓冲液中，制成悬液，3000r/min 离心 30min，将上清液吸出转移至离心管中备用。
1.2.5.4 病毒基因组 DNA 的提取
使用病毒基因组 DNA 抽提试剂盒从 1.2.5.3 处理痂皮悬液中抽提病毒 DNA，具体操作步骤参照说明书进行。
1.2.5.5 PCR 检测
1.2.5.5.1 引物设计
参照相关文献[108]针对绵羊痘病毒 RNA pol 基因设计 1 对特异性引物，引物序列如下：
FP：5’-TTCACAAGTTCATACGAATCTAC-3’
RP：5’-ATGGGCAACAGACAAAGC-3’
引物由上海生工生物有限公司合成，预期扩增的目的片段为 1270bp。
1.2.5.5.2 PCR 扩增
以提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为ddH2O，12μL；PCR buffer 2.5 μL；P1、P2 各 1μL；DNA 模板 4 μL；dNTP 4 μL； Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，共计 25 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 预变性 5 min 95℃ 变性 35 s,52 ℃ 退火 55 s, 72 ℃ 延伸 90s, 35 循环，72 ℃ 延伸 10 min。PCR 反应结束后，取扩增产物于 1%琼脂糖凝胶电泳。电泳缓冲液为 1×TAE，以 100V 恒压电泳18min，用紫外检测仪观察凝胶电泳结果。
1.2.6 鉴别诊断
羊痘与羊口疮在临床症状及病理变化上有较多相似之处，故笔者参照本实验室人员设计的针对羊口疮病毒引物进行类症鉴别，引物序列分别为：
P1:5’-ATGAAGGCGGTGTTGTTGCT-3’
P2:5’-TCAATTGCCAGGGTTGAGG-3’
引物由上海生工生物有限公司合成，扩增目的片段大小为 864bp[109]。
2 结果
2.1 发生流行情况
本次疫情发生在农户自养的羊群中，羊群中绵羊数量为 130 只，羊群感染绵羊痘发病的数量为 30 只，发病率为 23%；病死数量为 5 只，病死率为 16.6%。其中各年龄段均有发病，死亡及发病以羔羊居多。
2.2 临床症状观察
病羊体温升高，精神萎靡，呼吸脉搏加速，呼吸困难，食欲不振，采食量减少甚至废绝。眼结膜潮红、肿胀，鼻孔流出浆液、粘液及脓性分泌物。腹部（如图 2-1：A）、乳房（如图 2-1：B）、唇部（如图 2-1：C）和尾部（如图 2-1：D）等部出现痘疹。严重的唇部出现水疱溃烂，严重影响羔羊采食，部分羔羊由于无法采食，体力虚弱，精神极度沉郁，甚至饥饿致死。月龄稍长些的羊自身体抗力较强，并未导致死亡，但羊全身无毛少毛处出现痘疹和丘疹，随病程的逐渐延长，丘疹逐渐扩大，继而变为水疱。羊群中有的羊已经耐过疾病阶段，水疱破溃结痂，身体逐渐康复，但结痂会在很长一段时间内存在。个别体质较差羊的水疱逐渐变为脓性，并引起脓毒血症，导致羔羊死亡。
2.3 病理剖检
剖检可见在大网膜、肺脏（如图 2-2：A）、肠浆膜、肾脏均有灰白色湿润结节。部分羊支气管黏膜出现痘疹，呈灰白色，突出表面，米粒大小。心包液增多、心肌弹性较弱；真胃、瘤胃浆膜出现（如图 2-2：B）红斑及大小不一的坚实结节；淋巴结巴结肿胀，切面出血。
2.4 病理组织学观察
镜下可见病死羊肺脏发生间质性肺炎，肺泡上皮细胞增生，肺水肿（如图2-3： A，B，C）；支气管黏膜上皮细胞增生（如图 2-3：D）；肝脏发生淤血、脂变，肝细胞胞浆中可见脂肪空泡（如图 2-3：E）；在变性坏死的棘细胞胞浆内出现圆形或椭圆形的嗜酸性病毒包涵体（如图 2-3：F）。
2.5 电镜负染
电镜负染可见圆形病毒粒子，长 220nm×宽 200nm，为典型痘病毒粒子样（2-4）。
2.6 PCR 扩增
利用绵羊痘病毒 RNA pol 基因序列设计特异性引物进行 PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出与预期片段大小一致的条带，大小为 1270bp，同时使用羊口疮特异性引物并未得到目的条带（图 2-5）。
3 讨论
3.1 羊痘的危害
养羊业在畜牧业中占有重要地位，对世界经济有着重要的意义[64]。最近十年来，我国饲羊数量迅速增加、羊群密度增大以及频繁的从国外引种，导致羊痘、蓝舌病、羊传染性脓疱皮炎等一些严重危害养羊业健康发展的病毒性疾病频繁发生[71]。羊痘是羊群中最为常见的病毒性传染病，目前世界各地均有发生。已有资料表明，该病常呈群发性流行，在易感羊群中发病率较高，若无继发感染死亡率一般在 10%~20%之间，且感染羊痘的病羊长时间食欲不振，引起机体消瘦、发育不良，导致其肉、奶等畜产品质量和数量以及生产性能的下降，从而给养羊业造成巨大的经济损失[59]。此外，羊痘在我国的出现限制了羊及其副产品的国际贸易，在一定程度影响了国家经济的发展。
目前，羊痘在我国多个省份都有所发生，其中以内蒙古、青海、甘肃等主要养羊地区最为严重。根据农业部兽医局 2013 年公报结果，当年全国共有 10 个省及自治区出现羊痘，其中内蒙古的发病数量为 1716 只，居全国之首，是羊痘发生最为严重的地区。辽宁省作为北方一个主要养羊省区，在该地区羊群中也不断有羊痘的发生。在本研究中，我们对 2012 年 9 月辽宁锦州地区某羊群中 1 起疑似绵羊痘疫情进行诊断，证实引起“痘疹”发生的原因为 SPPV 感染所致。
3.2 羊痘的诊断
羊痘的临床症状十分典型，兽医临床上通常可以根据流行病学、羊群的发病情况及病羊的临床症状进行初步诊断[30]。然而由于近几年来羊口疮、蓝舌病等与羊痘临床症状极其相似的疾病的频繁出现，临床诊断方法并不能够进行确诊，经常出现误诊的现象。确诊羊痘需要在充分掌握临床资料的基础上，结合电镜观察、病理组织学观察以及 PCR 等更相关的实验室诊断方法进行。2012 年 9 月，辽宁锦州某地区一养殖场爆发疾病，以皮肤无毛少毛处出现痘疹为主要特征，病羊体温升高，流脓性鼻液，精神极度沉郁，食欲废绝，结合该病的临床症状，初步将其诊断为绵羊痘。为进行确诊，本研究将从病理学及病原学角度进行系统的研究分析。
本研究首先将送检羊的心、肝、脾、肺、肾、胃、皮肤等组织制作成病理切片，从病理组织学角度对羊的死亡原因进行分析。病理组织学观察结果可见，皮肤棘细胞胞浆内出现嗜酸性包涵体，该病变为羊痘的一个重要示病病变，可作为临床诊断的重要依据；肺脏发生间质性肺炎，肺泡上皮细胞增生，肺水肿；支气管黏膜上皮细胞增生，出现化生现象；肝脏发生淤血和脂变，推测其原因可能是病羊长期无法采食和营养不良造成的。
之后，我们从病原学角度进行进一步的验证分析，首先对皮肤结痂研磨处理上清液进行电镜负染观察，可见大小为 200~250nm 的病毒粒子，形态呈卵圆形，为典型的痘病毒粒子形态。之后设计合成针对羊痘病毒 RNApol 基因的特异性引物进行 PCR 检测，扩增结果显示，获得与预期目的片段大小一致的条带；而其它病原的扩增结果为阴性。此外，细菌学检测结果排除了混合感染的可能性。通过综合分析该病的临床症状、病理组织学观察以及病原检测结果，证实该病在羊群中爆发的原因为 SPPV 感染。该项项目研究不仅为临床上羊群中羊痘的诊断和防治提供理论依据，同时也有重要的公共卫生意义。
4 小结
4.1 病理组织学观察可见皮肤棘细胞胞浆内出现嗜酸性包涵体，肺脏发生间质性肺炎，肺泡上皮细胞增生，肺水肿；支气管黏膜上皮细胞增生，出现化生现象。
4.2 病原学检测结果显示，电镜负染可观察到典型的痘病毒粒子，PCR 扩增获得与预期目的片段大小一致的条带；细菌的分离鉴定结果排除了细菌混合感染的可能，从而证实该病在羊群中爆发的原因为 SPPV 感染所致。
