2.3 绿原酸提取工艺研究
2.3.1 试验材料
见附录表 2.36，2.37。
2.3.2 试验方法
2.3.2.1 超声提取法工艺流程
称取杜仲叶粉末若干份，每份 0.5g，于 20mL 试管中，加入一定量 30%乙醇溶液调节pH 值室温避光浸泡 1.5h，放入超声波洗涤器中在一定功率下超声提取一定时间后过滤、滤液离心，定容到 10mL，取上清液 250μL，加水定容到 10mL。4℃避光保存备用。
2.3.2.2 超声提取法单因素与正交试验设计
上述提取流程中，在 pH=4，40KHz 功率下，提取时间 60min，液固比为 20 的基础条件下，分别改变这四个因素进行单因素试验。具体因素水平如表 2.13。正交试验因素水平设计，见表 2.14。
2.3.2.3 微波提取法工艺流程
称取杜仲叶粉末若干份，每份 0.5g，于 20mL 试管中，加入一定量 30%乙醇溶液调节pH 值室温避光浸泡 1.5h，放入微波炉中在一定火力下辐射一定时间后，加入 30%乙醇溶液定容到 10mL，过滤、滤液离心，冷却后再定容到 10mL，取上清液 250μL，加水定溶至 10mL。4℃避光保存备用。
2.3.2.4 微波提取法单因素与正交试验设计
上述提取工艺流程中，在 pH=4，微波火力为中火，微波辐射时间 90s，液固比为 20的基础条件下，分别改变这四个因素进行单因素试验，因素水平如表 2.15。正交试验因素水平设计见表 2.16。
2.3.2.5 酶法提取工艺流程
称取杜仲叶粉末若干份，每份 0.5g，于 20mL 试管中，加入一定量体积分数 30%的乙醇溶液调节 pH 值，室温避光浸泡 1.5h，加入一定量 40℃活化 10min 的酶液，40℃水浴酶解反应一定时间后过滤、滤液离心。冷却后定容到 10mL，取上清液 250μL，加水定容至10mL。4℃避光保存备用。
2.3.2.6 酶法提取单因素与正交试验设计
上述提取工艺流程中，在 pH=5，酶用量 0.4%，酶解反应时间 1h，液固比 20 的基础条件下，分别改变这四个因素进行单因素试验，具体因素水平如表 2.17。正交试验因素水平设计见表 2.18。
2.3.2.7 热浸提取法工艺流程
称取杜仲叶粉末若干份，每份 0.5g，于 20mL 试管中，加入一定量体积分数的 30%乙醇溶液，调节 pH 值，室温避光浸泡 1.5h，置于一定温度水浴锅中提取一定时间后过滤、滤液离心。冷却后定容到 10mL，取上清液 250μL，加水定容至 10mL。4℃避光保存备用。
2.3.2.8 热浸提取法单因素与正交试验设计
按照上述提取工艺流程，在 pH=4，提取温度 70℃，提取时间 0.5h，液固比为 20 的基础条件下。分别改变这四个因素，进行单因素试验，具体因素水平如表 2.19。正交试验见表 2.20。
2.3.2.9 四种工艺绿原酸提取液色谱图比较
通过对四种工艺最佳条件下绿原酸得率及提取液色谱图分析，确定绿原酸提取的最适工艺。
2.3.3 结果与分析
2.3.3.1 超声提取法单因素试验结果
由图 2.7 可知，当溶剂 PH 值不断增大时，绿原酸得率呈先增大后减小趋势，PH=4 时绿原酸得率最大为 0.9008%。由图 2.8 可知，当超声频率不断增大时，绿原酸得率呈先增大后减小趋势，40KHz 时时绿原酸得率最大为 0.9020%。图 2.9 可知，绿原酸得率随超声处理时间延长，表现先增大后缓慢下降的趋势，在超声 80min 时绿原酸得率最大，为0.9013%。由图 2.10 可知，绿原酸得率随液料比的增大表现出先逐渐上升后缓慢下降的趋势，当液料比为 16 时绿原酸得率最大，为 0.9170%。
2.3.3.2 超声提取法正交试验结果
由上表可知，超声功率 40KHz， 超声时间 80min，料液体积质量比 14，此时绿原酸得率最高为 0.9032%。正交试验结果表明，绿原酸超声提取试验中，各因素对绿原酸得率影响从大到小顺序为：超声功率(A)＞时间(B)＞液料比(C)，即超声功率对绿原酸得率影响最大 。
2.3.3.3 微波提取法单因素试验结果
由图 2.11 可知，随着微波火力的加大，绿原酸得率呈现先增大后减小趋势，中火时绿原酸得率最大为 0.9174%。图 2.12 可知，当微波辐射时间不断延长，绿原酸得率表现先缓慢增大后快速下降的趋势，在辐射时间为 90S 时绿原酸得率最大，为 0.9288%。由图 2.13可知，绿原酸得率随液料比的增大表现出逐渐上升的趋势，当液料比为 16 时上升趋势变得缓慢，此时绿原酸得率为 0.9170%。
2.3.3.4 微波提取法正交试验结果
由上表可知，微波火力为中火，辐射时间 60s，液料体积质量比 18，此时绿原酸得率最高为 0.9313%。正交试验结果表明各因素对绿原酸得率影响从大到小顺序为：微波火力(A)＞辐射时间(C)＞液料比(B)，即微波火力对绿原酸得率影响最大。
2.3.3.5 酶法提取单因素试验结果
由图 2.14 可知，随着 pH 增大，绿原酸得率呈先增大后减小趋势，pH=5 时绿原酸得率最大为 0.9471%。图 2.15 可知，随酶用量增加绿原酸得率先增大，在酶用量 0.4%以后绿原酸得率变化幅度微小，酶用量 0.4%时绿原酸得率为 0.9435%。由图 2.16 可知，绿原酸得率随酶解时延长表现先增大，后趋于平稳状态，酶解时间 1.5h 时绿原酸得率最大，为0.9358%。由图 2.17 可知，绿原酸得率随液料比的增大呈现先增大后缓慢降低的状态，液料比为 16 时绿原酸得率最大，为 0.9374%。由图 2.18 结果，可以看出，当酶促反应处于不断升温时，绿原酸产率呈现先增大后降低的趋势，酶解温度为 40℃时绿原酸得率最大，为 0.9276%。
2.3.3.6 酶法提取正交试验结果
由上表可知，酶解 pH=4.5，酶解温度 40℃，酶用量 0.35%，此时绿原酸得率最高为0.9508%。正交试验结果表明，酶解各因素对绿原酸得率影响从大到小的顺序为：酶解 pH(A)＞反应温度(B)＞酶用量(C)，即酶解 pH 值对绿原酸得率影响最大。
2.3.3.7 热浸法提取单因素试验结果
由图 2.19 可知，随着浸出环境不断升温，绿原酸得率呈先增大后减小趋势，70℃时得率最大为 0.9618%。由图 2.20 可知，70℃水浴浸提半小时绿原酸得率最大，为 0.9630%，而后逐渐减小。由图 2.21 可知，绿原酸得率随液料比的增大，先增大后趋于稳定，液固比16 时绿原酸得率最大，为 0.9618%。
2.3.3.8 热浸法正交试验结果
由上表分析可得，热浸温度为 70℃、热浸时间 0.5h、液料体积质量比 18，此时绿原酸得率最高为 0.9654%。正交试验结果表明，热浸提取各因素对提取结果影响从大到小顺序为：液料比(C)＞热浸温度(A)＞热浸时间(B) 。
2.3.3.9 四种工艺绿原酸提取液色谱图比较
由前面各工艺提取结果可知，杜仲叶绿原酸不同提取工艺最佳条件下，绿原酸得率从高到低依次为：热浸提取 0.9654%＞酶法提取 0.9508%＞微波提取 0.9313%＞超声提取0.9032%。对应色谱图如下：
从色谱图对比分析可知，四种提取方法的色谱峰出峰时间、顺序、整体峰形基本一致，且在 300nm 检测绿原酸峰面积所占总峰面积比例基本一致分别为 82.755%、81.722%、82.574%、83.202%，结合四种不同提取方法，绿原酸提取液的定量结果及色谱图分析，得出杜仲叶绿原酸提取的最适工艺为热浸提取。
2.3.4 讨论
2.3.4.1 超声提取技术
试验超声发生装置为超声清洗仪，操作简单，利用超声空化作用对植物细胞进行破碎，促进绿原酸更好的扩散到提取溶剂中，超声提取法由于不需加热便可达到破碎植物细胞的目的，因此对于植物热敏性成分的提取不失为一种理想的方法；超声提取也存在弊端，试验发现超声法提取植物有效成分，原料投入量较少，适合实验室应用，若应用到工业化生产中，生产原料投料量将受限制；当超声频率低于 40KHz 时，噪声明显，因此超声提取若用于工业化生产还可能造成声波污染。
2.3.4.2 微波提取技术
试验中使用的微波发生装置为家用微波炉，单因素试验可知液料比一定的情况下，中高火时随着辐射时间的延长，绿原酸得率先升高后下降。这可能由于绿原酸存在不稳定的结构有关，如果加以持续较高的温度，这种结构会分解，最终造成，绿原酸产率下降。
此外，由于微波具有选择性加热而且升温速度很快的的特点，所以对于不同组织加热要控制好微波辐射时间。对于一些易破碎的目标组织，需处理的时间较短，此时溶剂还没有开始升温，这样不但提高了中药提取效率还节省了溶剂；而对于较难处理的目标组织，需要加热较长时间，此时溶剂也开始升温且速度很快，造成溶剂损失。
2.3.4.3 酶法提取技术
根据植物细胞壁组成特点（主要成分为纤维素），及其对中药有效成分提取的影响（细胞内药效成分溶出的障碍），又结合了酶具有专一性的特点，试验选用纤维素酶水解杜仲叶细胞壁。试验中酶解反应条件温和，酶解试验在恒温水浴锅中即可进行，对设备要求不高，甚至有些酶解反应在室温即可进行，大大节约了药效成分提取的仪器成本；此外，酶具有高效性特点，很少量的酶就可以达到很好的酶解效果。但是，酶法提取容易使酶在药材提取液中残留，给产品的后期处理带来困难。因此，如果解决酶后期去除的问题，酶法提取中药有效成分，有着广阔的应用前景。
2.3.4.4 热浸提取技术分析
此方法提取设备简单，只需恒温水浴锅即可。与超声提取及微波提取相比，热浸提取可以大量投料；与酶法提取相比不需要外加催化剂，简化了后续除杂工作。综合考虑，适于工业生产推广。
2.3.4.5 四种工艺绿原酸提取液色谱图分析
四种提取方法的色谱峰出峰时间、顺序、整体峰形基本一致，表明 4 种方法制得的绿原酸提取液化学成分基本相同；在 300nm 检测绿原酸峰面积所占比例均达 80%以上，说明杂质所含比例均较少。从绿原酸得率，工艺工业化推广的可能性等方面考虑，热浸提取法与其它三种提取工艺相比更具优势。
2.3.5 小结
试验通过单因素与正交试验相结合的方法，成功探索出超声、微波、酶法及热浸提取法的各优化条件，通过色谱图分析可知热浸法提取为绿原酸提取的最适工艺。
