中文摘要
鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶 LySP2 在毕赤酵母中的表达及其初步应用
鸡白痢作为我国农业部要求重点监测的 14 种动物疫病之一,其病原菌对禽类的危害严重制约着养禽业的发展.鸡场鸡白痢的净化是根除本病的最佳方法.抗生素是防治鸡白痢的传统药物,但由于抗生素的长期广泛使用甚至是滥用导致耐药性日益严重,使得鸡白痢的防治和清除愈加困难.噬菌体及其裂解酶作为新型抗微生物制剂在改善食品、医疗安全等方面被广泛研究和应用,因此筛选鉴定高效鸡白痢沙门菌的噬菌体及其裂解酶,用于鸡白痢的防治和净化具有重要意义.
本研究前期分离获得一株沙门菌噬菌体 YSP2,针对裂解酶 LySP2 基因序列,设计并合成引物 LySP2-ZF 和 LySP2-ZR,并在其 5'端添加 Xho I 酶切位点和编码序列 AAAAGA,在其 3'端插入限制性内切酶 Xba I 的酶切位点.利用 Xho I 和Xba I 分别双酶切 LySP2 与载体 pPICZ-αA,将目的片段连接后构建重组质粒pPICZ-LySP2.经 Sca I 单酶切线性化后,电转化至毕赤酵母 X33 中,通过 PCR鉴定、序列分析及 Zeocin+抗性筛选获得了能够高效表达裂解酶 LySP2 的阳性菌株 X33-pPICZ-LySP2.
通过摇瓶发酵,分别对温度、时间及甲醇浓度等参数进行优化,最终确定在29 °C,1.5 %甲醇诱导培养 96 h 可使发酵产酶活性达到最高,发酵上清液的总蛋白浓度达到 1.97 mg/mL;经 SDS-PAGE 及蛋白灰度分析,可见 17 kDa 表达条带,表达量为 238.76 ?g/mL,占发酵上清液总蛋白量的 12.12 %.发酵上清液中的裂解酶 LySP2 的 pH 值和温度适应性较好,在 pH 值 3 - 9 条件下酶活均保持在 85 %以上,在4 °C - 40 °C作用30 min,酶活力基本无损失.研究表明重组裂解酶LySP2抑菌活性及热稳定性良好,对酸碱的耐受范围广,具有较好的应用前景.
通过对 3 日龄雏鸡灌喂 0.5 mL 菌液(菌浓度为 106CFU/mL),建立了雏鸡的鸡白痢感染模型.治疗实验表明,连续口服 1010PFU/mL 噬菌体或 60 ?g/mL裂解酶可使雏鸡存活率达到 70 %,而攻菌组或酵母对照组的存活率低于 30 %,表明重组裂解酶 LySP2 对鸡白痢的治疗有一定临床意义.在雏鸡的鸡白痢感染模型中进行的沙门菌清除试验结果表明,裂解酶治疗的雏鸡肝脏内沙门菌的清除率达到 100 %,肠道内沙门菌清除率达到 50 %,与攻菌组雏鸡肝脏和肠道沙门菌的清除率相比差异极显着,表明裂解酶能有效清除雏鸡体内沙门菌.此外,对雏鸡的鸡白痢感染模型的肝脏和肠道的组织病理学实验结果显示,重组裂解酶LySP2 可减轻器官的病理损伤.
综上所述,本研究构建筛选获得了能高效表达沙门菌噬菌体裂解酶的毕赤酵母表达菌株.通过摇瓶发酵诱导所表达的重组裂解酶 LySP2,其体外抗菌活性良好;体内可提高雏鸡的存活率,清除雏鸡体内鸡白痢沙门菌,降低脏器病理损伤.
因此重组裂解酶 LySP2 在治疗鸡白痢沙门菌引起的鸡白痢具有较好的应用潜力,为后续对裂解酶 LySP2 的抗菌活性机制研究及推广应用奠定了基础.
关键词: 鸡白痢沙门菌,噬菌体裂解酶 LySP2,毕赤酵母,应用.
Abstract
Expression and preliminary application of Salmonella pullorum phage lyase LySP2 in Pichia pastoris
Salmonella pullorum is one of the most serious pathogens in the poultry industry,and it is also one of the 14 animal diseases that the Ministry of Agriculture requires tomonitor. The purification of Pullorum disease infection is the best way to eradicate this disease. Antibiotics are traditional medicines for Pullorum disease. The seriouslyincreased drug resistance has made the prevention and clearance of Pullorosis disease more difficult, due to the long-term abuse of antibiotics. Phage and its lyase have beenwidely studied and applied as novel antibacterial agents in improving food and medical safety. Therefore, screening and identification of high-efficiency phage and lyase of Salmonella pullorum are important for the prevention and purification of Pullrosis disease.
A Salmonella phage YSP2 was isolated at the early stage. In this study, synthetic primers LySP2-ZF and LySP2-ZR were designed based on the sequence of the lyase LySP2 gene measured in the previous stage. The Xho I restriction site and the coding sequence AAAAGA were added at the 5' end, and the restriction endonuclease Xba I restriction site was inserted at the 3' end. After LySP2 and the vector pPICZ-αA were digested with Xho I and Xba I, the target fragment was ligated to construct the recombinant plasmid pPICZ-LySP2. The recombinant plasmid was linearized by Sca I digestion and electroporated into Pichia pastoris X33. High expression positive strain X33-pPICZ-LySP2 was obtained by PCR identification, sequence analysis and Zeocin + resistance screening.
The fermentation conditions were optimized, and the optimum fermentation temperature of the recombinant yeast strain was 29 °C. The fermentation supernatant was prepared at a concentration of 1.97 mg/mL by adding 1.5% methanol and inducing 96 h. The supernatant was analyzed by SDS-PAGE, and there was a band around 17 kDa. The percentage of the target protein LySP2 in the total protein of thesupernatant was 12.12%, and the expression in the fermentation supernatant was 238.76 μg/mL. The lyase has high temperature resistance. The fermentation product was treated at 4-40 °C for 30 min, and the enzyme activity was unchanged. At 50-90 °C, the enzyme activity showed a significant downward trend, and the remaining enzyme activity was about 54.17%. Meanwhile, the lyase can be adapted toa wide range of pH values, and the enzyme activity is maintained above 85% after treatment at pH 3-9. The activity assay showed that LySP2 had significant bactericidal activity under suitable conditions, and its thermal stability and acid-base resistance possess good application.
Salmonella pullorum infection model of chicks was established by feeding 0.5 mL of Salmonella solution (the concentration of Salmonella pullorum was 10 6 CFU/mL) to 3 day-old chicks. The results showed that continuous feeding of 10 10 PFU/mL phage or 60 μg/mL lyase could achieve a survival rate of 70% in chicks,while the survival rate of supernatants with yeast control group or infection group was less than 30%. Therefore, the recombinant lytic enzyme LySP2 has certain clinical significance for the treatment of Pullorosis disease. The results showed that the liver of the chicks treated with lyase could completely eliminate Salmonella pulmonium and clear half of the Salmonella pulmonium in the intestine. Compared with the infection group, the clearance rate of Salmonlla in liver and intestinal was extremely different, indicating that the lytic enzyme can effectively remove Salmonella pulmonium in the chicks. In addition, the histopathological sections of the liver and intestine of the chick model were observed. The results showed that the recombinant lytic enzyme LySP2 can effectively alleviate pathological damage of organs.
In conclusion, this study constructed the Pichia pastoris expression vector that efficiently expressed Salmonella pulmonium phage lyase and secreted the recombinant lytic enzyme LySP2. The recombinant lytic enzyme LySP2 has good antibacterial activity in vitro, and can significantly improve the survival rate of chicks, remove Salmonella pullorum in chicks, and reduce pathological damage of organs in vivo. LySP2 has great application potential in the treatment of Pullorosis disease by Salmonella pullorum, which lays a foundation for further evaluation on antimicrobialactivity and application of the lyase.
Key words: Salmonella pullorum, phage lyase LySP2, Pichia pastoris, application.
前 言。
鸡白痢是由鸡白痢沙门菌（Salmonella pullorum）引起的细菌性传染病，是危害禽类养殖业最严重的疾病之一。禽类沙门菌病的流行与发展要追溯至 20 世纪初期，由于 7 日龄内雏鸡的肠道菌群建立尚不完全，导致沙门菌极易感染雏鸡，并造成雏鸡营养缺乏，生产性能下降等危害。目前鸡白痢的发生日益严重，其高达 10% - 60%的致死率，严重影响着种蛋的孵化率、出雏率及成活率，往往给禽类养殖业带来巨大的经济损失。鸡白痢传统的防治方法是使用抗生素类药物，但由于其耐药性和药物残留等弊端，使得近年来国内外开始研究生物防治或生态防治，试图开发绿色饲料添加剂，以求解决上述问题。从种鸡入手，对种鸡场进行鸡白痢综合防治及种鸡逐只检疫净化，是目前防治该病的最有效措施之一。欧洲等发达国家通过平板凝集试验淘汰抗体阳性鸡，净化效果显着[1]；我国养禽业也逐渐开展种蛋的净化工作，从源头根除病原菌。
噬菌体是一种能特异性感染细菌的病毒颗粒[2]，随着生物技术的发展和人们对噬菌体的认识加深，噬菌体作为生态制剂已被广泛研究甚至批准应用。噬菌体裂解酶是噬菌体在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶。与噬菌体相比，噬菌体裂解酶具有以下特点：一是噬菌体裂解酶作用的特异性，只作用于相应的靶细菌，不干扰宿主体内的正常菌群；二是噬菌体裂解酶作用机制与抗生素完全不同，不易产生耐药性；三是噬菌体裂解酶可以与抗生素联合使用；四是噬菌体裂解酶作为一种酶类，不会对机体产生致病性；五是噬菌体裂解酶可以基因工程化，实现规模化发酵生产。
本研究在前期获得一株裂解能力较强的鸡白痢沙门菌噬菌体的基础上，利用毕赤酵母表达系统对该噬菌体的裂解酶 LySP2 进行诱导表达，对表达产物开展体外抑菌活性、稳定性研究，对体内治疗效果、沙门菌清除效果及安全性等方面进行评价，为噬菌体裂解酶 LySP2 的活性机制研究及推广应用奠定基础。
第一篇 文献综述。
第一章 鸡白痢沙门菌研究概况。
目前全球已分离出 2610 多种不同的沙门菌（Salmonella）血清型[3, 4]，在我国发现的血清型近 200 种[5]，其中鸡白痢沙门菌可引发禽类急性或慢性传染病。 该病传播途径广、污染面积大，具有排白色粥样粪便，肝脏、脾脏肿大，贫血及肠道出血等典型症状[6]。鸡白痢沙门菌病多呈急性败血性经过，其大规模传染的特点严重制约着禽类养殖业的发展[7]。氯霉素、四环素、氨苄西林等抗生素是预防和治疗鸡白痢的传统药物。在长期使用这类药物的过程中，人们发现抗生素会产生多种不良后果。其一是许多抗菌药物会在动物产品中残留，直接危害人类的身体健康。其二是抗生素的滥用会导致病原菌发生变异，耐药菌株不断出现，为防治鸡白痢带来种种困难。
1.1 鸡白痢沙门菌病的流行现状。
为了净化防治鸡白痢，欧美等国家制定了一系列严格的检疫灭菌计划。一些欧洲国家的官方数据显示，净化措施的成功实施已将鸡白痢沙门菌清除[8]。但事实上，许多国家的官方数据和疾病报告是不完全的。墨西哥曾宣布鸡白痢被彻底清除，但该病在 3 年和 5 年后相继爆发。英国、西班牙、丹麦等国家也相继报告了鸡白痢在自由放养的鸡群及野生鸟类中爆发的案例。净化鸡白痢是困难的，放养鸡群及野生禽类是鸡白痢沙门菌的最佳宿主，野生鸟类的频繁迁徙和鸡群广泛的自由放养也是诱发鸡白痢频繁爆发的原因之一。
中国是鸡白痢的高发地区，对各地区抽检鸡的血清样本，通过血清平板凝集试验对鸡白痢抗体检测。结果显示，费强等[9]检测的 1189 份血清样品中，阳性率达 8.07 %。吴玙彤等[10]检测的 2255 分血清样本中，总感染率为 30.60 %。周廷宣等[11]检测的 1113 分血清样本中，不同品种、性别的病鸡感染程度差异较大，阳性率达 10.90 %。鸡白痢沙门菌长期存在于禽类养殖场的因素有多种。一是经济利益影响，通常感染鸡白痢的成年鸡呈隐性感染，因此养鸡场对鸡白痢的检疫频率较低。带菌鸡的存在导致病原菌在环境中长期存在并持续传播。二是饲养管理水平低下，养鸡场的温度、通风、水质、饲养密度、饲料品质、环境卫生等条件恶劣，使得大量滋生的病原菌极易感染鸡群。三是饲养人员缺乏防治意识，禽类养殖场引进幼禽和种蛋时，检疫、筛选、消毒等工作缺乏造成了鸡白痢在鸡群中持续传播的现象；饲养人员长期对抗生素的不规范化使用，增强了病原菌的多重耐药性，导致抗生素类药物对鸡白痢的防治效果大打折扣。
为了彻底根除鸡白痢，我国学者曾提出对种鸡场实施净化措施。但净化过程复杂、生物安全措施要求高、投入成本大等问题导致中小型养鸡场的净化措施无法达标，因此真正净化鸡白痢的禽类养殖场在国内并不多见[12, 13]。
1.2 鸡白痢沙门菌病发病机理及国内外耐药现状。
1.2.1 发病机理。
健康机体的肠黏膜屏障主要由上皮细胞膜和黏液凝胶层组成[14]。病原菌入侵机体后，穿过黏液层粘附在黏膜上皮细胞中[15]，破坏上皮细胞组成的物理屏障，使黏膜屏障功能进一步恶化[16, 17]，从而使大量病原菌入侵、滋生。病原菌释放的毒素及生物活性物质对宿主细胞和组织造成损伤，血管内水分、离子等向肠道外渗透引发肠炎。当沙门菌引起败血经过时，沙门菌细胞壁组成之一的脂质 A 具有内毒素活性，它可抑制机体内巨噬细胞的吞噬、杀伤作用，引起发热、出血、白细胞异常、弥漫性血管内凝血、循环衰竭等症状。
1.2.2 耐药现状。
抗生素多为抗微生物药物，在动物饲料中添加亚治疗剂量的抗生素能有效防控畜禽疾病，提高机体生长性能，为畜牧业带来了可观的经济效益。据统计，美国有 45 %的抗生素应用于畜牧业，其中大量抗生素作为饲料添加剂被使用。欧洲各地半数以上的抗生素应用于肉用动物，在我国每年有近千吨的金霉素和近万吨的土霉素被应用于食用动物中[18]。然而，抗生素并不能被机体完全吸收，有高达 85 %的抗生素经动物排入环境中，对土壤和水源造成污染，将产生大量耐药细菌，对人类健康构成了潜在威胁。
现阶段，我国中小型禽类养殖场仍盲目用药，如随意增减药物使用剂量、随意增减药物使用时间、不经过药敏试验随意选用抗生素、长期使用同种药物等，这种临床上大量滥用抗生素的现象导致了多重耐药沙门菌的出现[19]。各国对沙门菌的监测数据显示，多重耐药沙门菌在世界各地陆续出现[20]，尤其在我国，禽类养殖业滥用抗生素，致使禽源性沙门菌的耐药率处于较高水平。据 2012 年调查数据显示，肠炎沙门菌中耐十种以上抗生素的菌株高达 25 %。原丽丽等[19]
临床分离 160 株沙门菌中，88.13 %可耐三种及以上药物，耐 10 种及以上的菌株有 15株，由此可见沙门菌对抗生素耐药情况相当严峻。体外药敏实验中显示，常用于防治鸡白痢的几种抗生素，其抑菌环直径均已下降到 10 mm 以下，表明此类药物在临床中的防治效果已微乎其微。
目前，沙门菌耐药机制主要包括药物的作用位点基因突变、阻断或扰乱药物进入、改变抗生素结构、改变细胞膜通透性等[21, 22]。因此防治工作中应经常性分离致病耐药菌株，药敏试验测定其最佳用药，减少单一抗生素使用频率，选择新药交叉使用等。
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1.3 鸡白痢沙门菌病的防控趋势
第二章 沙门菌特异性噬菌体及其裂解酶的研究进展
2.1 噬菌体作为抑菌剂防治沙门菌
2.2 噬菌体应用的流行及局限性
2.3 裂解酶治疗的应用与发展
第二篇 研究内容
第一章 裂解酶 LYSP2 的酵母真核表达系统的构建
1 材料
1.1 主要仪器
1.2 菌株及质粒
1.3 试剂
1.4 试剂配制
1.5 引物设计与合成
2 方法
2.1 鸡白痢沙门菌的培养
2.2 沙门菌噬菌体 YSP2 的培养
2.3 沙门菌噬菌体 YSP2 基因组的提取
2.4 裂解酶 LySP2 基因的 PCR 扩增
2.5 表达载体 pPICZ-LySP2 的构建与鉴定
2.6 重组毕赤酵母菌株 X33-pPICZ-LySP2 的构建
2.7 重组毕赤酵母菌 X33-pPICZ-LySP2 的诱导发酵及条件优化
2.8 发酵上清液总蛋白浓度测定
2.9 发酵产物的电泳检测
3 结果
3.1 噬菌体 YSP2 全基因组提取结果
3.2 重组质粒 pPICZαA-LySP2 的鉴定结果
3.3 重组质粒 pPICZα-LySP2 序列测定结果
3.4 重组酵母菌株 X33-pPICZ-LySP2 的构建结果
3.5 重组酵母菌株 X33-pPICZ-LySP2 的发酵产酶结果
3.6 重组毕赤酵母菌 X33-pPICZ-LySP2 产酶条件的优化结果
3.7 重组菌株 X33-pPICZ-LySP2 的诱导产物 SDS-PAGE 分析结果
3.8 发酵产物的活性鉴定
3.9 发酵上清蛋白总浓度测定
4 讨论
4.1 噬菌体 YSP2 及其裂解酶 LySP2.
4.2 裂解酶 LySP2 的表达及活性
5 小结.
第二章 重组裂解酶体外抑菌活性及雏鸡模型的治疗效果
1 材料
1.1 重组裂解酶、实验动物及菌株
1.2 主要仪器
2 方法
2.1 平板打孔法检测抑菌活性
2.2 重组酵母发酵产物最小抑菌浓度（MIC）测定
2.3 重组裂解酶的 pH 值稳定性测试
2.4 重组裂解酶的热稳定性测试
2.5 重组裂解酶制剂的安全性测试
2.6 鸡白痢沙门菌雏鸡感染模型的建立
2.7 重组裂解酶在清除鸡白痢感染雏鸡模型中的疗效
2.8 数据统计分析
3 结果
3.1 重组裂解酶抑菌活性鉴定结果
3.2 重组裂解酶 MIC 测定结果
3.3 重组裂解酶的热稳定性测试结果
3.4 重组裂解酶的 pH 值稳定性测试结果
3.5 重组裂解酶安全性检测结果
3.6 重组裂解酶在鸡白痢感染雏鸡模型中的疗效
4 讨论
4.1 裂解酶活性
4.2 裂解酶稳定性
4.3 裂解酶的体内活性
5 小结
结 论
1. 构建了重组裂解酶 LySP2 基因的毕赤酵母表达菌株 X33-pPICZ-LySP2，利用甲醇诱导可分泌表达有抑菌活性的重组裂解酶 LySP2，对其抑菌圈直径可达30.15 mm，表达量可达 238.76 ?g/mL。
2. 重组裂解酶 LySP2 的热稳定性良好，对酸碱耐受范围广。在 pH 值 3-9条件下作用 30min，酶活均保持在 85 %以上，在 4 °C - 40 °C 温度条件下作用 30min，酶活力基本无损失，具有较好的应用前景。
3. 重组裂解酶 LySP2 不仅对沙门菌具有裂解作用而且对大肠埃希菌也具有裂解活性，比噬菌体 YSP2 的裂解谱宽。
4. 体内实验中，重组裂解酶 LySP2 对雏鸡鸡白痢沙门菌感染模型的保护率为 70 %，肝脏沙门菌清除率可达 100%，肠道沙门菌清除率可达 50 %。
参考文献
