原代胰腺癌组织中CD133+/ABCG2+细胞群分选及抗药性分析

　　胰腺癌恶性程度极高，确诊后生存率很低，是美国癌症病死亡原因的第四位或第五位，占胃肠道癌症死亡的 1/5。由于胰腺位于腹膜后，症状、体征的不明显和不典型使之难以得到早期治疗，临床治疗效果差，总的 5 年生存率仅为 5% 左右。目前，手术切除癌肿是治疗早期胰腺癌唯一有效的根治方法，而放化疗等综合性治疗的效果均不满意。因此，分子水平研究原发性胰腺癌的发生、发展和复发、转移及耐药性机制，已成为当今胰腺癌研究中的热点和难点。本研究拟利用流式细胞仪分选(FCM Sorting) 技术从原代胰腺癌组织中分选出CD133 + / ABCG2 + 的细胞群，并且通过相关实验来检测分析其特异性指标，从而确定该群细胞在胰腺癌发生、发展和转移中的作用，为后续肿瘤化疗药物的筛选提供有效模型。

　　1 材料与方法

　　1． 1 CD133 + /ABCG2 + 人胰腺癌亚群细胞的筛选:无菌条件下收集胰腺癌患者手术中切除的肿瘤组织，用 PBS 清洗组织 2次，剪去除组织中的坏死组织等，将肿瘤组织浸泡于青霉素(1000U / mL) 和链霉素(1000U / mL) 混合液中 10min。弃去浸泡液，将肿瘤组织剪成直径 1mm 的组织小块，然后加入 5 倍体积的胰酶消化液(0． 25%胰酶含 0． 02% EDTA)，于 37℃环境下震荡消化 30min。随后，加入 5 倍体积的含 10% 胎牛血清的细胞完全培养基加以终止，上下颠倒震荡使细胞脱落，过 200 目筛网，于 1500r/min 离心 5min。收集细胞沉淀，加入 100μL 预冷的 PBS 缓冲液，随后加入 rabbit anti － human CD133 － FITC 和rabbit anti － human ABCG2 － PE monoclonal antibodies ( eBio-science 生物科技有限公司) 各 4μL，并于 4℃ 环境中避光孵育30min。利用流式细胞仪( BD FACSAria，BD Bio － science，CA，USA) 将 CD133 + / ABCG2 + 和 CD133 － / ABCG2 － 分选出来，并悬浮于无血清的干细胞培养基［DMEM/F12，10ng/mLbasic fi-broblast growth factor(bFGF)，10 ng/mL epidermal growth factor(EGF)，5μg / mL insulin 和 0． 5% bovine serum albumin ( BSA)，上述试剂均购于 Sigma － Aldrich 试剂公司］中，在37℃、5%CO2的环境中培养。

　　1． 2 RNA 抽提与实时荧光定量 PCR( qRT － PCR) 检测:按 Tr-Izol Reagent 说明书的步骤，抽提各组细胞的 Total RNA，并且利用 ReverTra Ace M － mLV Reverse Transcriptase 和寡核苷酸引物 Oligo(dT)18 经 RT － PCR 生成对应的 cDNA。测定其浓度，－ 20 ℃ 保存。以上述反转录获得的 cDNA 作为模板，在 Ep-pendorf RealPlex4( Eppendorf CO． ，LTD) 上，利用两步法进行qRT － PCR，根据相对定量法( mRNA 的相对变化量 Ratio = 2 －ΔΔCt ︱ ΔΔCt =［ΔCt_CD133 + /ABCG2 + － ΔCt_ CD133 － /AB-CG2 － ］) 计算目标片段的扩增比例。扩增产物以 2% 的 AgroseGel 电泳进行分析。检测中设立空白对照( blank control)，均以ddH2O 作为模板，各样本设立 3 个重复，以 18SrRNA 作为内参。

　　1． 3 免疫荧光( IF) 鉴定:各组细胞用 PBS(0． 02 moL /L，pH7．4) 清洗 2 次，然后用 4% 多聚甲醛溶液常温下固定 20min 固定液，用封闭液(0． 02mol/L PBS 中加入 0． 2% Triton －100 和 5%正常山羊血清)在 37℃ 下封闭 60min。弃封闭液，用 PBST(0．02mol / L PBS 中加入 0． 2% Triton － 100) 漂洗 3 次，每次 5min。

　　弃废液，加入一抗(rabbit anti － human Oct3/4 antibody; rabbitanti － human Nanog antibody; Santa Cruz 公司) ，于 37 ℃ 下孵育45min。反应完毕后，用 PBST 漂洗 3 次，每次 10min，然后加入荧光标记二抗(goat anti － rabbit Cy3 － conjection antibody; SantaCruz 公司) 及 DAPI，于 37℃ 下避光孵育 45 min。反应结束后，用 PBST 漂洗 3 次，用 50%丙三醇封片，荧光显微镜观察拍照。

　　1． 4 软琼脂(Soft Agar)克隆集落形成实验:在 42℃ 水浴中，将存储浓度为 1． 2%的低熔点琼脂糖与 2 × 细胞完全培养基以 1:1(v/v)混合，形成终浓度0． 6%的底层琼脂，取1． 4mL 加入6 孔板的一个孔中。待完全凝固后，取对数期细胞吹打成单细胞悬液，并调细胞浓度为 2 ×104/ mL。再将存储浓度为 0． 6% 的低熔点琼脂糖与2 ×细胞完全培养基以1:1(v/v)混合，形成终浓度为0． 3% 的上层琼脂，取 1． 0mL 上层琼脂与 0． 1mL 细胞悬液充分混匀，加入已有下层琼脂的 6 孔板中，待其凝固后，置于 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养3 周，计算细胞克隆集落形成率。

　　1． 5 MTT 比色法检测肿瘤干细胞耐药性:各组细胞接种于 96孔细胞培养板中(密度为 2 × 103)。在药物组孔中分别加入30nmoL / μL 的顺铂和 35nmoL / μL 的吉西他滨，而阴性对照组中分别加入等体积的 PBS 缓冲液，置于 37℃，5% CO2环境中分别培养 24，48，96h。在检测前的 4h 加入 MTT 20μL(5mg/L)，继续培养 4h。离心去上清且加入 DMSO 溶解沉淀。用酶标仪在490nm 处读取所对应的吸光度值( D490)，设立 3 个复孔，取其平均值。测得各孔吸光度数值，利用公式:(1 － 实验组 D 值/对照组 D 值) ×100%，计算出药物对于细胞的增殖抑制率。

　　1． 6 Western blot 检测:收集各组细胞，根据 Western blot Kit 说明书中的步骤，抽提各组细胞的总蛋白，利用 Lowry 法测定总蛋白浓度，以每个泳道 20μg 浓度的蛋白样品上样，经 30% 变性SDS － PAGE 电泳后，利用半干电转化法将蛋白转移至 PVDF 膜上，经过封闭、一抗(稀释倍数 1:1000)孵育、PBST 洗脱、HRP 标记的二抗(稀释倍数 1:500)孵育、PBST 再洗脱等步骤后，ECL化学发光及 X 光片暴光，并且经定影显影处理，获得清晰条带。利用 BandScan 软件分析各条带的 A 值。

　　1． 7 裸鼠致瘤实验:收集各组细胞、离心、收集沉淀，利用冰预冷的 PBS 重悬细胞，调整至细胞密度为10000/μL。取2 只裸鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)，分别于背部皮下组织注射20μL 细胞悬液，其中 1 只注射 CD133 + / ABCG2 + 细胞，另 1 只注射 CD133 － /ABCG2 － 细胞。所有裸鼠均饲养于相同的环境(SPF 级) 中，每周观察一次背部瘤体形成情况。

　　1． 8 亚硫酸氢钠处理及甲基化特异性 PCR( MS － PCR) 鉴定ABCG2 启动子甲基化: 抽提各组细胞的基因组 DNA，并按CpGeno － meTM DNA Modification Kit 说明书的步骤完成基因组DNA 的体外修饰。取各组细胞重亚硫酸盐修饰后的基因组DNA(2μL) 作为模板，同时在 PCR 管中分别加入上下游引物(0． 01nmoL) 各 0． 5μL、2 × HotStart Taq PCR MasterMix 10μL 及ddH2O7μL，使得 MS － PCR 总反应体系为 20μL。根据引物序列及 PCR 反应过程及温度进行 MS － PCR 检测。PCR 反应完成后，其产物进行 1． 5% 琼脂塘凝胶检测，并且利用 BandScan 软件分析各条带的 A 值。

　　1． 9 统计方法:本实验数据以均数 ± 标准差( x珋 ± s) 表示，利用SPSS10． 0 统计软件对数据进行方差分析( ANOVA) 或独立样本t 检验，P ＜ 0． 05 认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2． 1 CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞高表达干细胞标志:本研究中，我们共收集了 3 例胰腺癌患者的手术切除肿瘤组织(编号为:PC1 － PC3)，都为胰腺导管腺癌，病理分期为Ⅱ期。通过胰酶消化和流式细胞分选技术，我们从胰腺癌组织中获取了CD133 + / ABCG2 + 的细胞亚群。经过流式细胞仪检测发现，在胰腺癌原代细胞中，CD133 + /ABCG2 + 细胞亚群所占的比例非常小，而绝大多数肿瘤细胞为 CD133 － /ABCG2 － 细胞(占总细胞数的)。原代的 CD133 + /ABCG2 + 和 CD133 － /ABCG2 － 均以无血清培养基在体外进行悬浮培养(suspended cultured)，当传代至第9 代的时候，CD133 － /ABCG2 － 出现大量的死亡细胞，而CD133 + / ABCG2 + 细胞成团生长，其中细胞颗粒小且密集，折光度好，显示出非常好的生长状态(图1)。我们利用 qRT － PCR 检测了各类细胞群干细胞生物标志(bio markers)表达情况，实验结果表明，CD133 + /ABCG2 + 细胞群较 CD133 － /ABCG2 － 细胞群高表达 SoX2、Oct4 等干细胞标志(图2)。同时，Western blot 和免疫荧光(IF)检测也同样显示了 CD133 + /ABCG2 + 细胞群较CD133 － / ABCG2 － 细胞群高表达干细胞生物标志( 图 3)。实验证实，CD133 + /ABCG2 + 细胞群具有典型的干细胞特性。

　　2． 2 CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞在体外增殖能力明显增强且具有高侵袭性:选择第 7 代的细胞，每 2d 统计一次细胞的增殖数量，连续计算 10d，统计结果表明，CD133 + /ABCG2 + 细胞亚群自第 4 天起出现明显的增殖趋势，而 CD133 － /ABCG2 － 亚群细胞至第 6 天才进入增殖期。结果表明，CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞具有很强的自我增殖能力(图 4)。同时，细胞克隆形成实验证实，CD133 + /ABCG2 + 亚群细克隆形成能力明显高于CD133 － / ABCG2 － 亚群细胞( 图 4) 。
　　
　　2． 3 CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞具有高耐药性:MTT 实验结果显示，在顺铂或吉西他滨药物刺激下，CD133 － /ABCG2 － 细胞呈现出显着的增殖抑制现象，其增殖抑制强度与化疗药物刺激时间的长短具有明显的相关性(图 4)。而 CD133 + /ABCG2+ 细胞对于顺铂或吉西他滨均表现出很好的耐受性，在各个时间点上，其增殖抑制率均显着低于 CD133 － /ABCG2 － 细胞。结果证实，CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞具有较高肿瘤细胞化疗药物耐受性。

　　2． 4 CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞具有高致瘤性:选取少量的细胞(约为10000/μL)接种于裸鼠背部皮下。大约在 8 周之后，CD133 + / ABCG2 + 细胞接种鼠的背部可以观察到有明显的瘤体产生，而接种 CD133 － /ABCG2 － 细胞的裸鼠背部相同位置上并未发现有瘤体。继续饲养 2 周，CD133 + /ABCG2 + 细胞接种鼠的瘤体不断长大，而接种 CD133 － /ABCG2 － 细胞的裸鼠背部仍然未发现有瘤体长出(图 5)。裸鼠体内成瘤实验说明，CD133+ / ABCG2 + 细胞具有典型的肿瘤干细胞强致瘤性的特征。2． 5 多耐药基因 ABCG2 启动子区域在 CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞中呈现去甲基化状态:两组细胞的基因组 DNA 经重亚硫酸盐处理后，以 ABCG2 启动子区甲基化和非甲基化特异性引物进行 MS －PCR 检测。实验结果显示，在 CD133 + /ABCG2 + 亚群细胞中，ABCG2 非甲基化引物 PCR 结果呈现出阳性条带，而在CD133 － / ABCG2 － 亚群细胞中，ABCG2 非甲基化扩增的 PCR 产物则无明显条带，提示 CD133 + /ABCG2 + 细胞亚群中，ABCG2启动子区域存在去甲基化现象(图 6)。该实验证实，CD133 + /ABCG2 + 胰腺癌细胞中，由于 ABCG2 启动子去甲基化而导致其高表达，使其具有较强的化疗耐药性。该研究中，利用 5 － Aza －CdR(10μmol/L)处理细胞，作为 MS －PCR 检测的阴性对照。3 讨 论肿瘤学传统观点认为，肿瘤中每个瘤细胞都具有无限增殖和形成克隆瘤灶的的能力，但具体哪个瘤细胞能够形成新瘤灶是随机的。而现在颇受关注的“肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell)学说”则对此种观点提出挑战。该学说认为，肿瘤组织中存在着一小群肿瘤干细胞(或起始细胞);其单个细胞即可发展为肿瘤，具有干细胞自我更新和多向分化能力等特征。此种学说还认为，肿瘤干细胞是恶性肿瘤形成的起始细胞，维持着肿瘤的生长，可能是肿瘤复发、转移、耐药机制的根源。

　　利用流式细胞术来分选出具有特定分子标志的细胞群体是筛选肿瘤干细胞的经典方法。肿瘤学研究发现，肿瘤干细胞来源于一群边缘细胞群(Side Population，SP)，亦称之为侧群细胞。1996 年 Goodle 等利用流式细胞术研究骨髓细胞的细胞周期时发现，经过 Hoechst33342 染色后并非所有的细胞都可发出蓝色荧光，而有大约不到 0． 1% 的细胞并未被染料着色。

　　然而，这群细胞却高度表达干细胞的标记 sca1 + /Lin －。相关研究同时还指出，SP 细胞之所以能够不被 Hoechst33342 染色，是由于其高度表达 ABCG2 蛋白。ABCG2 蛋白全称为 ATP结合 G 蛋白偶联超家族泵蛋白成员，其存在可以将一些小分子染料(Hoechst33342、罗丹明 123 等)及化疗药物等物质通过离子交换形式泵出细胞外，以避免这些物质对细胞生理生化活动的干扰。由此可见，在肿瘤细胞中，ABCG2 蛋白的表达情况与肿瘤耐药性具有密切的联系;而肿瘤干细胞之所以高度耐药，与其细胞膜上 ABCG2 蛋白的过度表达关系密切。

　　本试验中，利用流式细胞仪分选(FCM Sorting)技术从原代胰腺癌组织中分选出 CD133 + /ABCG2 + 的细胞群，并且通过细胞体外增殖实验、耐药性实验、软琼脂克隆形成实验、荧光定量PCR 及 Western Blotting 分析其耐药性、干细胞标志、肿瘤克隆形成率及迁徙特性，结果表明该亚群细胞高表达干细胞标志物(如:Oct4、SoX2)，和普通胰腺癌细胞相比，具有更强的侵袭性和克隆形成能力以及更强的化疗耐药性。另外裸鼠体内成瘤实验表明该亚群细胞具有更强的体内成瘤能力。随后，通过DNA 甲基化检测证实，多耐药( multi － drug resistant) 基因 AB-CG2 启动子差异性甲基化是导致该细胞呈现出化疗药物耐受性的重要原因。【图略】

　　参考文献:

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