星形细胞肿瘤为神经外科领域的难治性疾病之一,寻找其新的治疗手段成为当前研究的热点,随着分子生物学、分子遗传学、分子免疫学及转基因技术等学科的发展,发现了许多与该肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因,尝试应用基因治疗方法来治疗星形细胞肿瘤,具有很好的应用前景。
DEK原癌基因最初在(6;9)(p23;q34)染色体异位的一类急性髓性白血病(acutemyelocyticleukemia,AML)亚型中发现,其高表达与肿瘤密切相关,在宫颈癌、鼻咽癌等恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的发生、发展变化,以及一些肿瘤的耐药性相关。
本研究应用 Westernblot法检测 DEK蛋白在星形细胞肿瘤和正常脑组织中的表达水平,探讨其在星形细胞肿瘤发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 一般资料收集
2007年 6月 -2009年 2月中国医科大学盛京医院神经外科手术切除并经病理证实的星形细胞肿瘤标本 32例及颅脑外伤、脑出血病人行内减压手术取得的正常脑组织标本 5例,包括男 19例,女 18例。所有病例均为初次治疗,术前未接受放、化疗,去除出血、坏死及电凝灼烧组织,经 10%福尔马林固定后石蜡包埋。按 WHO神经系统肿瘤分类标准(2000年)将标本分组,低级别星形细胞肿瘤组(Ⅰ级毛细胞型星形细胞瘤和Ⅱ级弥漫性星形细胞瘤)共 14例,高级别星形细胞肿瘤组(Ⅲ级间变性星形细胞瘤和Ⅳ级胶质母细胞瘤)共 18例;对照组为正常脑组织标本共 5例。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质样品的制备 50-100mg组织在裂解缓冲液(50mmol/LTris-HCl、250mmol/L蔗 糖、2mmol/LEDTA、1mmol/LEGTA、10mmol/L2-ME、0.5% TritonX -10、10mmol/LPMSF)中匀浆,15000转/分 4℃离心 5min,取上清于 -70℃保存。按照蛋白定量试剂盒(DCProteinassay)的说明进行下述操作:首先将 20μl试剂加入1mlA液中变成 A',然后将蛋白标准品分别稀释成 1.42、0.85、0.63、0.47、0.28μg/μl;取 5μl标准品和样品加入干净干燥 EP管,加入25μlA'和 200μlB液,室温混合 5min,15min后应用紫外可见光分光光度计于 750nm测定蛋白吸光度值,并根据标准曲线得出蛋白实际含量。
1.2.2 SDS-PAGE电泳 将玻璃板用清洗剂洗净,晾干。配制 12%分离胶,将分离胶注入玻璃板夹层中,上面流出灌注积层胶所需空间(梳子的齿长再加上 1cm)。用吸管在胶面上覆盖一层超纯水,保持胶面平整,将凝胶垂直放置在室温下。待分离胶完全聚合后(30min),倾出覆盖层的液体,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。配置好 4%浓度的浓缩胶,将其直接灌注在已聚合的分离胶面上,立即在浓缩胶中插入干净的梳子,小心避免混入气泡,再加入浓缩胶液以充满梳子间的空隙,将凝胶垂直放置在室温下。待浓缩胶完全聚合时,将待分析的蛋白质样品置于 1×SDS凝胶加样缓冲液中,100℃加热 3-5min使蛋白质变性,插入冰浴冷却后上样。在电泳槽中加入电泳缓冲液,拔出上样梳,然后用注射器洗干净加样孔,用微量加样器分别吸取待分析样品,根据蛋白质的浓度和加样孔体积决定加样量。
加样完毕后,接通电源,起始时用低电压或低电流,当样品在浓缩胶部分浓缩成一条直线,进入分离胶后,将电源电压或电流提高,继续电泳直至溴酚蓝指示剂到达分离胶底部边缘时即可停止电泳。从电泳装置上卸下玻璃板,放在纸巾上,撬开两层玻璃,取出凝胶。
1.2.3 转膜 将电泳后的胶取出浸入转移缓冲液中,水平摇床缓慢摇 30min,裁取相同大小的硝酸纤维素膜(PVDF),甲醇浸透,弃去甲醇后浸入蒸馏水或 1×TBS中,再将 PVDF膜浸入转移缓冲液中至少 5min。用转移缓冲液浸湿一张厚滤纸,铺于半干转印仪的底层电极板上,将 PVDF膜铺于滤纸上,勿留气泡,将凝胶贴于 PVDF膜上,不留气泡,润湿另一张滤纸,盖在凝胶上,用玻璃棒赶去气泡。盖上顶层电极板,接通正负极电源,15V(不超过 25V)转印 10-30min。
1.2.4 杂交 取出 PVDF膜,1×TBS洗一次,和胶相邻面向上浸入封闭液中置于水平摇床缓慢摇 1小时至过夜。倒掉封闭液,用洗膜液略洗一下,加入用杂交液按 1∶1000稀释的DEK一抗,在摇床上室温杂交 30-90min。取出 PVDF膜,用洗膜液洗 3次,每次 5-15min。倒掉洗膜液,加入用杂交液按比例(1∶2000)稀释的辣根过氧化酶标记的二抗,摇床上杂交 30-60min。取出膜,用洗膜液洗 3次,每次 5-15min。
1.2.5 化学发光反应(ECL) 倒掉洗膜液,将 PVDF膜夹于吸水纸中,吸去多余的液体,转膜时和胶相邻的一面向上,铺于玻璃板上。将 ECL试剂盒内 detectionreagent1与 detec?tionreagent2等体积混合后,均匀滴在 PVDF膜上,反应1min。夹起 PVDF膜,用吸水纸吸去多余液体。用保鲜膜包好 PVDF膜,固定于片夹内,准备曝光。
1.2.6 洗片 裁好底片,大小与膜相当,压片。显影 3min,水中漂洗几次,定影 10-15min,清水冲洗,根据显影时间,确定下一张曝光时间。在膜上标记出 Marker的分子量。自动电泳凝胶成像分析系统(ChemiImager5500)下自动成像,F1uorChemV2.0系统分析目的蛋白条带的 IDV,将 DEKIDV与 β-actin蛋白条带的 IDV比值作为 DEK蛋白的相对含量。重复实验 3次,取平均值行统计学分析。
1.3 统计学分析
采用 SPSS13.0统计软件进行统计学处理。所有数据以均数 ±标准差(珋x±s)表示,组间比较用 One-wayANOVA方差分析,并用 LSD检验或 Dunnett'sMuilipleComparisonTest做多个样本间的两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
在正常脑组织中未检测到 DEK蛋白表达,大部分星形细胞肿瘤组织中均有 DEK蛋白表达,其表达强度随星形细胞肿瘤级别增加而上升,低级别星形细胞肿瘤组织 DEK蛋白的相对含量与高级别星形细胞肿瘤相比,差异具有显着性意义(P<0.05,表 1、图 1)。【表1.图1略】
3 讨论
星形细胞肿瘤的发生、发展非常复杂,是多因素、多基因、多种恶性转化作用积累的结果,随着研究的深入,一些与星形细胞肿瘤发病相关的重要基因相继被发现,其中包括Rb、p53、p16、多肿瘤抑制基因(MTS1、MTS2)等。研究还发现星形细胞肿瘤常出现 9、10、13、17和 22号染色体的杂合性缺失。星形细胞肿瘤的难治性与其过度增殖、对抗凋亡及旺盛的血管形成等恶性生物学特性密切相关,针对星形细胞肿瘤的发病机制寻找新的治疗靶点并探索新的治疗方法,对于攻克人类这一顽疾有着重要的科学意义和临床应用价值。
DEK蛋白最初是在急性白血病中被发现的一种磷酸化蛋白,该蛋白的磷酸化是一种重要的翻译后修饰,DEK蛋白与诱导细胞凋亡的功能密切相关。同时,DEK蛋白的磷酸化水平在细胞周期的不同时期中是不同的,在基因转录过程中 DEK可作为辅助性的激活因子或抑制因子起作用。因此,过表达的 DEK蛋白对细胞凋亡可能具有促进或抑制作用,但具体的机制目前尚不完全清楚,仍需深入研究。
我们的研究结果显示,正常脑组织中未检测到 DEK蛋白表达,93.75%星形细胞肿瘤组织中均有 DEK蛋白表达,其表达强度随星形细胞肿瘤级别增加而上升,可以推测 DEK参与了早期星形细胞肿瘤的发生、发展过程,其作用机制可能是抑制细胞的凋亡,从而促进细胞异常增殖,最终调控失常导致肿瘤发生。Carro等也报道过 DEK表达与肿瘤细胞增殖率存在密切正相关的观点,从而得出了 DEK是一种在多种实性肿瘤中有高水平表达并能够反应肿瘤细胞增殖状态的有效判定指标的结论,与本研究观点一致。
本研究还发现,DEK的表达随肿瘤的病理级别升高而逐步增高,在低级别星形细胞肿瘤组织中 DEK蛋白的相对含量为 0.55±0.11,在高级别星形细胞肿瘤组织中为0.85±0.07,两者间具有显着性差异,表明 DEK蛋白表达与星形细胞肿瘤的发生、发展呈显着正相关。Larramendy等报道DEK在肝细胞癌中存在较高的 mRNA表达水平,而且提出DEK可以作为肿瘤治疗新靶点的结论。最新研究应用Kaplan-Meier分析表明 DEK表达低的小细胞肺癌患者与DEK表达高的患者相比,有较高的整体生存率。而在对乳腺癌的研究中发现 DEK癌基因支持乳腺癌细胞增殖、浸润和维护的乳腺癌干细胞群,促进乳腺癌的发展,并且有针对性地抑制 DEK常规激素疗法可能会提高疗效。结合本研究可以推测 DEK作为原癌基因在促进星形细胞肿瘤进展中起着重要作用,是评估星形细胞肿瘤恶性生物学行为的可靠指标。KappesF在一组 147例黑色素细胞病变中检测 DEK表达时发现:大多数良性痣包括普通痣、发育不良痣、斯皮茨痣均为阴性,原位黑色素瘤也表现出类似良性痣,DEK表达弱阳性,而原发性浸润性黑色素瘤、转移性黑色素瘤免疫组化结果显示出 DEK强阳性表达;结果分析表明:DEK在浸润性黑色素瘤中的表达显着高于其在良性痣中的表达(P<0.0001),并且在深层黑色素瘤(布瑞斯罗夫深度 >1毫米)和转移性黑色素瘤的表达较表浅黑色素瘤(布瑞斯罗夫深度≤1毫米)强(P<0.05),由此推测,DEK的过度表达可能是浸润性黑色素瘤一个频发事件,DEK表达进一步增强,有提示预后不良的功能,如深部皮肤的侵袭和转移,DEK在黑色素瘤进展过程中发挥作用。结合上述研究结果可以认为DEK过表达可能是星形细胞肿瘤恶性度进展的一个重要事件,动态监测 DEK的表达可能对星形细胞肿瘤的复发、进展及预后的判断有帮助。
总之,随着对 DEK基因在星形细胞肿瘤的发生、发展过程中作用机制的进一步研究及对 DEKsiRNA的后续研究,DEK作为凋亡抑制基因是否能成为星形细胞肿瘤治疗的一个新靶点,值得关注。
