摘 要： [目的]蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa) 生长快、光合作用强、富含蛋白质和油脂等化合物, 可广泛应用于食品、医药和生物能源等行业。建立简易、安全和高效的藻细胞破壁技术是蛋白核小球藻等微藻高值天然化合物萃取及其商业化生产的关键环节之一。[方法]本文以蛋白核小球藻为试材, 以细胞破碎率和油脂得率为指标, 对超声波破壁法的条件 (藻液体积、藻细胞含水量等) 和参数 (功率、时间、温度等) 进行系统优化。[结果]结果表明, 超声波破壁最佳条件和参数为:室温25℃, 湿藻液pH5, 藻细胞含水量20%～50%, 超声波输出功率250 W, 处理时间为15min, 和处理量每次120mL。依此条件和参数进行处理, 蛋白核小球藻破壁率达94.8%, 油脂萃取率达40.1%。[结论]这一优化的超声波破壁方法简便高效、成本低, 对后续产品加工无负影响, 为建立蛋白核小球藻高值天然产物的规模化生产工艺提供了科学依据。
关键词： 蛋白核小球藻; 超声波; 细胞破壁; 油脂萃取;
Abstract： [Objective]Chlorella pyrenoidosa, a species of green algae with rapid growth rate, strong photosynthesis, and high content of both protein and lipid, has been widely investigated and recognized as a value-added product with remarkable pharmacological and biological qualities.One of the key steps of the extraction and commercialization of high-value natural products from Chlorella sp was to develop a simple, safe and efficient technique to break down cell wall.[Methods]In present study, Chlorella pyrenoidosa was used as the test microalgal materials, and lipid productivity and cell disruption rate were employed as the assay index to evaluate the cell disruption efficiency of different cultivation conditions including various algae volume, algal cell moisture, etc.and parameters such as ultrasonic power, treat time, and temperature, etc.by ultrasonic treatment.[Results]The results showed that optimal conditions and parameters for cell disruption by ultrasonic treatment were determined as room temperature at 25℃with wet algae pH value at 5;algae cell water content was 20%～50%, and ultrasonic output power at 250 W with treatment time and volume at 15 min and 120 mL, respectively.Under such conditions and parameters, the cell broken rate and lipid extraction rate of Chlorella pyrenoidosa were reached up to 94.8% and 40.1%, respectively.[Conclusion]This optimized ultrasonic treatment method is regarded as simple, efficient, low-cost, and moreover, no negative impact on the processing of subsequent products.The present data provided a scientific basis for the establishment of a large-scale production system for high-value natural products from Chlorella pyrenoidosa.
Keyword： Chlorella pyrenoidosa; Ultrasonic treatment; Cell wall disruption; Oil extraction;
微藻是一类能光自养的单细胞或多细胞群体藻类, 生长速度快、单位面积生物质产量高, 特别是一些微藻能高水平合成积累油脂, 可用于生产食用油、工业用油和生物柴油。微藻光合作用还可以吸收并有效利用大量工业废气中的CO2及氮化物, 可用于生物减排和治理环境污染[1]。此外, 微藻细胞还能合成积累多种化合物, 亦可用来生产具有高附加值生物基产品, 如脂肪、多糖、色素、抗氧化剂、虾青素、优质蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素等多种营养及生物活性物质, 这些化合物已广泛应用于化妆品、药物、食品、农业以及化学工业等多个领域[2]。
蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa) 是一种球形单细胞淡水藻类, 光合效率高、繁殖能力强, 分布范围广, 分类上为绿藻门、小球藻属[3]。蛋白核小球藻不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、叶绿素、多种维生素和矿物质等营养物质[4], 且含有大量的油脂, 既可用于食品、医药、饲料等行业, 还可以用于生产生物柴油等。尤其是蛋白核小球藻营养成分全面均衡, 被誉为完美的天然营养食品[5]。几年来, 蛋白核小球藻规模化养殖联产健康食品等产业化发展迅速、市场需求日益增加。然而, 蛋白核小球藻具有坚韧的细胞壁结构, 制约着细胞内储存的蛋白质、油脂、藻多糖等营养物质有效萃取和产品加工[6]。未破壁的全藻细胞作为食物原料直接食用, 其营养成分被吸收和利用率极低。因此, 建立安全、有效的藻细胞破壁工艺是蛋白核小球藻等微藻营养及功能产品生产的关键环节之一[7]。目前, 微藻细胞破壁的方法主要分为机械法和非机械法[8]。非机械法如酸热法、有机溶剂和生物酶法等使用大量的化学试剂或生物酶, 不仅成本高、还会影响到萃取化合物的质量, 这些方法多用于实验室规模破壁, 不具备规模化生产的潜力[9]。机械法破壁如超声波、研磨法等优势在于破壁较充分, 适用于各种藻类, 无污染且适用于大规模生产。与研磨法耗时长、成本高以及仅限于实验室规模相比, 超声波破壁作为一种物理方法有明显优势, 它是利用大于20kHZ的超声波使细胞壁破碎, 耗能较低、细胞破碎均匀、物质萃取率较高、无污染, 操作简单便捷, 有望实现连续化和规模化破壁[10]。迄今, 还没有建立应用超声波处理对蛋白核小球藻进行破壁的较完善技术工艺。本文以本实验室分离获得的富油蛋白核小球藻藻株CP-SX05为试材, 以藻细胞破碎率和油脂萃取率为评判指标, 通过对超声波处理所涉及到的藻细胞密度 (g·mL-1) 、藻细胞含水量、湿藻液pH、藻液量/体积和超声波输出功率、处理时间以及温度等参数进行优化, 以期建立蛋白核小球藻简易有效的超声波破壁方法, 为后续建立规模化微藻破壁及油脂等天然化合物萃取的高效低成本工艺奠定基础。
1、 材料与方法
1.1、 试验材料
1.1.1、 藻种及培养
藻种为本实验室前期分离鉴定纯化获得的一株蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa) CpSX05, 该藻株生长速度很快, 且油脂和蛋白质含量高, 是可商业化应用的一个优良株系。
培养:本研究选出了最适合上述藻株生长和油脂积累的BG-11培养基, 其母液成分及工作液组分见表1和表2。培养液pH为7左右, 室温23℃, 光照3 500lx, 通气条件:CO2含量为3%, 通气速率为5L·min-1, 培养9~10d。
1.1.2、 试剂与仪器
试剂:蒸馏水, 三氯甲烷, 甲醇, 正己烷, 石油醚, 浓盐酸, 氢氧化钠, 氯化钠, 乙醚, 浓硫酸。
仪器:AX523ZH/E精密电子天平, Jan-78磁力加热搅拌器, HY-2A调速多用振荡器, PS-100AL超声波仪, HHS-21-4电热恒温水浴锅, MLS-3 781L-PC高压灭菌锅, KH-55AS电热恒温干燥箱, BCD-539WT冰箱, ALLEGRA X-30R离心机, ALPHA 1-4LD冷冻干燥机, STARTER2100pH计, BIC-400光照培养箱, JTONE-J1-3微波炉, BC-R205C旋转蒸发仪, DHG-9 076A数显鼓风干燥箱, GCMS-QP2010Ultra气相色谱质谱联用仪, Agilent 7890B气相色谱仪。
表2 BG-11工作液配方Table 2 Working solution formulations of BG11
1.2、 试验方法
1.2.1、 油脂含量的测定
取蛋白核小球藻50mL, 与正己烷1∶1混匀, 在摇床上过夜12h, 离心收集上清液, 蒸馏干燥放入烘箱烘干后称重。油脂提取率按下式计算:
油脂提取率/%=W/ (Wn×V) ×100%
式中:W为提取的油脂质量/g;Wn为每毫升藻液藻粉干重/g·mL-1;V为藻液体积/mL
1.2.2、 OD值测定及藻细胞计数
利用可见光分光光度计测定蛋白核小球藻的OD680值, 藻细胞的个数利用血球计数板进行计数。
1.2.3、 蛋白核小球藻细胞干重的测量
取对数期的蛋白核小球藻的藻液, 8 000r·min-1离心5min, 倒掉上清液, 用蒸馏水重悬洗涤3次后离心弃上清, 置于冷冻干燥机中24h以后称重。
1.2.4、 藻细胞破碎率计算
细胞破碎率= (M-Mn) /M×100%
式中:M为视野中藻细胞原始个数;Mn为经过细胞破碎后视野中藻细胞个数。
2、 结果与分析
2.1、 蛋白核小球藻生长曲线
每天在同一时间取蛋白核小球藻液, 在最佳波长OD680进行吸光度测定, 3组平行重复, 绘制生长曲线。如图1所示, 蛋白核小球藻生长曲线呈“S”型。培养前3d, 蛋白核小球藻生长速度缓慢, 处于生长停滞 (缓慢) 期。在生长4d后, 蛋白核小球藻细胞生长速度大幅度增长, 细胞数量也呈指数递增, 进入对数生长期。从第11天开始蛋白核小球藻进入了静止期, 细胞生长速度下降。
图1 蛋白核小球藻的生长曲线Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa
2.2、 含水量对藻细胞破壁率的影响
分别取不同含水量的蛋白核小球藻100mL, 摇匀。在温度为20℃, 输出功率为200W, 超声时间为6min, 破碎10s后间歇10s。在显微镜下统计破壁前后视野中完整细胞的个数, 然后计算细胞破碎率, 3次平行计数。由图2可见, 藻细胞破壁率随着含水量的增加呈上升趋势。含水量为20%~50%, 破壁率均达到90%以上。含水量大于50%时, 破壁率可上升到95%以上。但是, 藻细胞含水量越大, 藻液浓度低, 处理效率和油脂提取率也降低。因此, 藻细胞含水量在20%~50%之间, 破壁效益最佳。
图2 含水量对藻细胞破壁率的影响Fig.2 Effect of water content on the broken rate of algae cells
2.3、 超声时间对藻细胞破壁率的影响
取含水量为30%的蛋白核小球藻100mL, 在温度为20℃, 输出功率为200W, 不同的超声时间下, 破碎10s后间歇10s。在显微镜下统计破壁前后视野中完整细胞的个数, 然后计算细胞破碎率, 3次平行计数。结果如图3所示, 破壁率随着时间的增加逐渐增大, 但是在前15min, 细胞破壁率随着超声时间增加大幅度上升, 在第15min时破壁率达到93.8%, 在15min以后增长不明显。综合考虑成本, 超声15min效益最佳。
图3 超声时间对藻细胞破壁率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the rate of rupture of algae cells
2.4、 超声功率对藻细胞破壁率的影响
取含水量为30%的藻液100 mL, 温度为20℃, 不同的超声功率下, 超声时间为6min, 破碎10s后间歇10s。在显微镜下统计破壁前后视野中完整细胞的个数, 然后计算细胞破碎率, 3次平行计数。结果如图4所示, 随着超声功率的增加, 细胞破壁率逐渐增加, 在250 W的时候破壁率达到94.1%, 250 W以后基本没什么变化。因此, 最佳超声功率选为250 W。
2.5、 超声处理温度对藻细胞破壁率的影响
取含水量为30%的藻液100 mL, 不同温度下, 超声功率为200W, 超声时间为6min, 破碎10s后间歇10s。在显微镜下统计破壁前后视野中完整细胞的个数, 然后计算细胞破碎率, 3次平行计数。结果如图5所示, 随着温度增加, 蛋白核小球藻的破壁率也在增加, 在25℃时, 细胞破壁率达到94.3%。在温度超过25℃以后, 细胞破碎率增加缓慢, 且过高的温度会破坏细胞的有机化合物。因此, 最佳温度确定为25℃。
图4 超声功率对藻细胞破壁率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on Shock broken rate of algae cells
图5 温度对细胞破壁率的影响Fig.5 Effect of temperature on cell breakdown rate
2.6 湿藻液pH对藻细胞破壁率的影响
取含水量为30%的藻液100 mL, 设置不同pH, 温度为20℃, 超声功率为200 W, 超声时间为6min, 破碎10s后间歇10s。在显微镜下统计破壁前后视野中完整细胞的个数, 然后计算细胞破碎率, 3次平行计数。结果如图6所示, 藻细胞在强酸性条件下, 破壁率高, 因为酸性会使细胞壁结构变疏松。但是, 强酸会使脂肪酸等有机物水解, 而且不适于进行大规模处理。所以, 确定湿藻液最佳pH为5。
2.7、 藻液体积对细胞破壁率的影响
取含水量为30%的不同体积的藻液, pH为5, 温度为20℃, 超声功率为200 W, 超声时间为6min, 破碎10s后间歇10s。在显微镜下统计破壁前后视野中完整细胞的个数, 然后计算细胞破碎率, 3次平行计数。如图7所示, 随着藻液量的增加, 小球藻的破壁率逐渐降低, 在藻液体积为120mL时破壁率最高达到94.8%。因此, 最佳藻液量确定为120mL。
图6 pH对藻细胞破壁率的影响Fig.6 Effect of pH on cell breakdown rate in algae
图7 藻液量对细胞破碎率的影响Fig.7 Effect of algae volume on cell broken rate
2.8、 优化后的超声法对油脂提取率的影响
由上述测试结果可知, 超声波破壁的优化参数为:藻液含水量为30%, 温度为25℃, 藻业体积为120mL, 超声时间为15min, 超声功率为250 W, pH为5。如表3所示, 没有超声破壁处理的蛋白核小球藻提取的油脂含量为20.4%, 经过研磨破壁处理后提取的油脂含量为39.8%, 比未破壁增加95%。经过优化的超声破壁后, 蛋白核小球藻提取的油脂含量为40.1%, 比未破壁增加96.8%。
表3 不同破壁方法对蛋白核小球藻油脂萃取的影响Table 3 Effect of different cell wall breaking methods on oil extraction in C.pyrenoidosa
3、 讨论
微藻光合固碳能力强, 具有较高的生长速度和较大的油脂积累量, 可广泛应用于能源、医药、食品等行业, 亦是最有前景的可再生能源的优质生物原料[11]。微藻破壁是微藻制油工艺以及其他化合物萃取工艺中的至关重要环节[12]。已有研究探讨提高细胞破壁率和减低成本的方法, 但现阶段微藻下游加工环节干燥和破壁耗能过高, 制约其产业化[13]。孙利芹等[14]采用反复冻融法, 在冷冻温度为-30℃, 对紫球藻细胞进行破碎, 破碎率达70%左右。孔凡敏等[15]利用酸热法提取酵母细胞内的油脂, 结果表明油脂最高提取率为39.87%。欧阳琴等[16]利用超声法和冻融法对雨生红球藻进行破壁处理, 细胞破碎率高达91.4%。
与其它已有的破壁方法相比, 超声法是一种操作简单、无污染、耗液量小的物理破壁方法, 且细胞破壁率较高。王雪青等[17]采用超声破碎处理衣藻, 破碎率可达90%以上。汤卫华等[18]利用超声波法、反复冻融法和匀浆法对三角褐指藻进行细胞壁破碎处理, 结果破壁率最高的为超声波破碎法, 破壁率达到91.5%, 油脂提取率为18.1%。
本研究以蛋白核小球藻为试材, 对超声破壁条件和参数进行了探索与优化。最佳条件为超声温度25℃, 超声时间为15min, 超声功率为250 W, 破碎率达到90%以上, 这与孙利芹等[15]研究的超声对紫球藻破碎效果相似, 并且蛋白核小球藻破壁率比紫球藻高。孔凡敏等[16]的研究中发现酸会使细胞壁的结构变疏松, 有助于细胞壁裂解。本文研究了藻液pH对蛋白核小球藻破壁率的影响, 结果表明pH越高细胞破壁率越低。pH低, 细胞破碎率高。但是, 大量的酸会增加成本, 不利于大规模培养和应用。所以, 本研究选择最佳pH为5, 细胞破壁率达到93.8% (图6) 。大多数的研究报道, 微藻油脂提取通常利用干藻粉, 然而微藻干燥过程会增加成本[19]。为了降低成本达到规模化的生产, 本试验选择湿藻体用于破壁和提油。结果表明, 随着藻细胞含水量的增大, 细胞破壁率逐渐增大, 在含水量达到20%~50%时, 细胞破壁率变化不明显, 均能达到92%以上 (图2) 。当含水量达到50%, 破壁率高达95%, 含水量高于50%, 破壁率虽然升高但油脂提取率明显降低。考虑对油脂提取率和能量消耗的影响, 藻细胞含水量选择20%~50%为最佳, 易于规模化应用, 这为蛋白核小球藻规模化养殖联产高营养价值及产品的生产加工提供了科学依据。利用研磨破碎法为对照, 测定优化的超声波破壁法对蛋白核小球藻油脂萃取效果的影响, 结果显示, 研磨破碎藻细胞后提取油脂得到的藻细胞含油量比没有破壁的藻细胞油脂萃取所得含油量增加了95%。利用优化的超声波法对蛋白核小球藻破壁处理后提取油脂所得含油量比没有破壁藻细胞萃取油脂所得含油量增加了96.8%。
4、 结论
本文建立了简易有效的蛋白核小球藻超声波破壁最佳条件和参数:室温25℃, 湿藻液pH5, 藻细胞含水量20%~50%, 超声波输出功率250 W, 处理时间为15min, 和处理量每次120mL。依此条件和参数进行处理, 蛋白核小球藻破壁率达到94.8%, 油脂萃取率达40.1%。这为蛋白核小球藻优异藻株CP-SX05规模化养殖联产高值营养及功能产品生产工艺的建立提供了科学依据。
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