全基因组测序技术在预防医学中的应用综述

　　传染病疫情暴发严重危害人类健康，造成巨大的经济损失。尤其是新型病原微生物出现并迅速扩散时，如严重急性呼吸综合征、新型禽流感、德国出血性大肠杆菌疫情等，还会引起社会的普遍影响。预防医学工作者对疾病的流行规律，以及对引起疾病的病原微生物本身缺乏足够认识，是很多情况下疫情防控措施不够合理的重要原因；而缺乏对新型病原和疾病的了解，是导致民众产生恐慌的因素之一。因此，在疫情出现早期，快速获得病原特性，掌握疾病流行规律，是实现有效防控的重中之重。

　　对病原微生物的全基因组序列测定可以迅速提供疫情防控所需要的信息[1-4] .基因组是遗传物质的载体，也是形成微生物特定表型的本源。在疾病流行过程中，病原体的基因组会以一定速率发生变异，这些变异忠实记录了病原传播所经历的自然选择和遗传漂变的作用[5].因此，测定病原微生物的全基因组序列，并应用比较基因组学和群体遗传学的分析方法研究这些序列及其变异情况，将能够预测病原微生物的重要表型，并反演病原传播的途径和选择压力。这些信息的获得将为针对性预防治疗和传播过程追溯提供必要的数据支持。

　　在过去30年中，基于基因组序列片段的分子分型方法与流行病学技术的结合极大地丰富了我们对病原的认识，脉冲场凝胶电泳、多位点串联重复序列分析、多位点序列分型（multilocus sequencetyping, MLST）等技术已经在国家疾病防控体系中广泛应用。但是直到近十年前，分辨率最高的全基因组序列分析却始终徘徊在主流预防医学研究领域之外，其主要原因是基于双脱氧链终止法的第一代核酸测序技术成本过高，且进行全基因组测序的周期太长（通常需要整年的时间），不适合常规监测以及应对突发疫情的需要。

　　2005年起，新一代测序技术走上历史舞台，将单个细菌全基因组序列测定所需的时间从1年缩短到几天甚至几个小时，测序成本也大幅度降低[6],至此全基因组测序技术才真正跨越基础研究的范畴，开始走入预防医学临床应用的广阔天地，并为该领域的研究带来革命性变革[4,7].

　　本文从流行病学调查和溯源、病原体特性预测、疾病流行规律分析、疫苗变异监测和使用效果评价4个方面，对全基因组测序技术在预防医学领域中的应用进行综述。

　　1流行病学调查和溯源

　　全基因组测序技术在预防医学中最直接的应用就是流行病学调查分析。病原体在不同宿主、媒介中复制和传播时，其基因组变异会以一定概率发生并累积下来。通过全基因组测序检测这些变异，并利用比较基因组学和群体遗传学分析手段重建样本间的系统发育关系，可以推测不同来源的病原体之间的传播关系，从而为流行病学和微生物法医学调查提供更完善的证据和补充。

　　此类研究最早应用于加拿大的一起社区胸膜结核疫情的回顾性流行病学调查[8].该社区在2年时间里陆续观察到41例患者。Gardy等[8]对来自患者的结核分枝杆菌进行测序和系统发育分析，并与传统流行病学调查数据获得的患者社会网络互相叠加，精确判定了传染源和传播途径。研究发现了引起多人感染的超级传播者，并证明疫情实际由2起同时发生，但具有各自独立传播途径的流行组成。该研究首次将全基因组序列分析整合到传统流行病学研究中，有力证明了全基因组测序技术在流行病学调查中的作用。全基因组测序的高分辨率特性使其在院内感染调查中起到不可替代的作用。

　　2009年，英国剑桥医院的新生儿监护病房发生了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin -resistant Staphylococcus aureus,MRSA）感染流行[9].由于同一家医院的MRSA分离株遗传距离非常接近，传统分型方法无法检测出不同患者MRSA分离株之间的差异，也无法判断院内感染源头和传播途径。而结合全基因组测序分析以及菌株的分离时间等信息，研究者得以清楚区分暴发菌株和普通患者携带的非暴发菌株，从而排除非暴发菌株携带者对流行病学调查造成的干扰，确定疫情流行的过程。另一个典型例子是对碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌院内暴发的分析[10].该研究将全基因组序列分析结果与患者出、入院及住院病房等资料结合，鉴定出传染源是一例患者，并发现该患者通过3条独立的传播路径引起其他17例院内感染。其中有2条传播途径涉及到无症状携带者以及医院下水道、通风系统等，这是通过基因组学分析发现而被传统流行病学调查手段所忽略的。

　　因此，基因组分析能够丰富传统流行病学研究结果，为制订有效防控措施奠定了科学基础。

　　全基因组序列分析还可应用于跨大洲的国际流行病学溯源研究。2010年10月，海地暴发了百年来首次霍乱疫情。疫情源头是来自拉丁美洲本地菌株还是联合国维和部队带来的外来菌株，曾一度引起强烈争议[11].通过对2株暴发菌株进行测序，并与拉丁美洲流行株和亚洲菌株序列进行比较，研究人员初步得到了问题答案：海地霍乱暴发不是拉丁美洲当地菌株所致，而是由于人类活动从遥远的外地带入[12].通过对更多暴发菌株及全球霍乱代表株进行全基因组序列分型（whole genome sequence typing,WGST），研究者发现南亚尼泊尔地区与海地的霍乱分离株WGST结果一致。尼泊尔分离的霍乱菌株可分为4个遗传发育分枝，海地暴发菌株是其中之一，与该分支其他尼泊尔菌株之间仅存在1或2个碱基的差异，证明海地霍乱暴发菌株来源于尼泊尔地区[13].上述分析为WHO对海地霍乱流行病学调查的最终结论提供了坚实证据，成为认识疫情流行规律与实施有效防控措施的关键。

　　2病原体特性的快速判定

　　通过对病原体全基因组序列的功能注释，以及与毒力因子数据库、耐药基因数据库等进行查询比对[14-15],可以预测包括病原体环境生存能力、毒力及耐药谱等的重要表型特性，为临床用药给予指导。尽管表型试验成本相对较低，也容易在普通实验室实现，但基于全基因组序列的病原体特性预测对于新型病原体和生长速度非常慢的病原体仍然有非常高的实用价值。

　　2011年5-7 月，大肠杆菌疫情在德国北部暴发，很快席卷整个德国和欧洲部分国家，并蔓延至美国和加拿大。合计感染人数达4000例以上，其中三分之一以上病例发展为溶血性尿毒综合征，超过50例死亡。尽管患者症状表现为典型的肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage Escherichia coli, EHEC）感染，但病原培养特性和MLST分析却发现暴发菌株与EHEC差距甚远，因此怀疑该菌株是一种新型致病性大肠杆菌[16-17].我们在疫情暴发之初，应用IonTorrent PGM测序仪3 d内完成了暴发菌株的测序，迅速确定了病原的性质[18].将暴发菌株与当时已发表的30株大肠杆菌完成图序列进行系统发育分析，结果表明导致暴发的菌株与肠聚集性大肠杆菌属于同一进化分支，但由于获得了编码志贺毒素的stx2基因，从而表现出EHEC的致病特点。对暴发菌株序列的注释结果表明，该菌株还携带了Ⅰ型聚集性粘附菌毛蛋白等毒力因子，以及27个耐药基因和19个重金属抗性基因，其中耐药基因预测结果与德国科赫研究所公布的暴发菌株耐药表型谱高度一致。上述遗传因子可能增强了该菌株的环境生存能力，从而促进病原的大范围传播。以上研究结果为认清病原特性、制订针对性防控措施提供了重要依据，也为暴发菌株的特异性检测方案设计打下基础[19].

　　抗生素耐药的全球扩散是WHO提出的威胁人类健康的全球三大首要问题之一，而结核分枝杆菌耐药性的研究一直是该领域的热点[20].由于结核分枝杆菌生长速度极慢，通过传统培养和表型方法进行耐药谱检测，至少要花费几个星期。

　　2013年新英格兰医学杂志上发表的一篇报道中，研究者将患者痰液放入分枝杆菌生长指示试管（mycobacterialgrowth indicator tube, MGIT）中进行培养，3 d后直接从培养物中提取DNA,并使用Illumina MiSeq测序仪进行测序[21].结果鉴定出患者混合感染了2种不同的结核多耐药菌株，并通过耐药基因的变异情况预测了耐药谱。通过序列分析获得的耐药谱准确包含了参考实验室通过培养检测得到的全部9种抗生素的耐药情况，并预测菌株可能对另外5种抗生素耐药（参考实验室未进行实验验证）。这项研究利用全基因组测序技术，将结核分枝杆菌耐药谱检测时间从几个星期缩短到几天，其推广应用将为结核分枝杆菌耐药的临床诊断带来革命性变化。