基于GQDs的荧光猝灭检测抗坏血酸的新方法
时间：2017-06-20 来源：发光学报 作者：赵丽敏,陈丽妮,赵书林 本文字数：8943字 摘要：基于石墨烯量子点（ GQDs） 的荧光性能建立了一种非标记荧光方法，用于灵敏和选择性测定抗坏血酸（ AA） .GQDs 溶液在紫外光激发下发出很强的蓝色荧光，当向溶液中加入 AA 后，GQDs 溶液的荧光被猝灭。猝灭机理可能为在弱酸性介质中，AA 与 GQDs 发生氧化还原反应，AA 转移电子给 GQDs.荧光猝灭强度与AA 浓度在 5. 0 × 10- 6~ 7. 5 × 10- 5mol / L 范围内呈良好的线性关系，检出限低至 1. 0 × 10- 6mol / L.该体系成本低、操作简单，并且在多种可能干扰的物质存在下对 AA 表现出很高的选择性。本方法应用于生物样品中AA 的检测，回收率在 95. 2% ~ 115. 3% 之间。
关 键 词： 石墨烯量子点； 荧光探针； 非标记方法； 抗坏血酸。
Abstract: A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantumdots （ GQDs） was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid （ AA） . The initialstrong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition ofAA. The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDs via the redox re-action of AA and GQDs in weak acid solution. The quenching efficiency was linearly proportional tothe concentration of AA within the range of 5. 0 × 10- 6- 7. 5 × 10- 5mol / L with a low detection limitdown to 1. 0 × 10- 6mol / L. The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experi-mental operations,and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species.Additionally,this method was successfully applied to the determination of AA in biological sampleswith satisfactory recoveries （ 95. 2% - 115. 3% ） .
Key words: graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid.
1 引 言。
石墨烯量子点（ GQDs） 是最近发现的粒径小于 100 nm 具有0 维结构的石墨烯纳米片[1-3].与石墨烯类似，GQDs 也有大的表面积和 π-π 共轭网状结构。作为一种新的碳纳米荧光材料，GQDs由于其优越的光稳定性、优良的光学和电化学性能、高的荧光活性、抗光漂白能力和低细胞毒性[4-8],已经在化学、材料、物理学和生物学领域引起较大关注并成为当前的研究热点之一，目前已用于氯离子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三价铁离子[12]、过氧化氢[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白 G[16]、生物巯基化合物[17-18]、脱氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的检测，以及用于药物释放[21]和生物成像[22-24]等领域。
抗坏血酸（ AA） 是一种重要的抗氧化剂，在人体平衡氧化压力中起重要作用。AA 在人体液中存在的浓度相对较高，例如，人血液中 AA 的浓度为 6 ~ 15 μg/mL[25].AA 是治疗坏血病、药物中毒、肝脏疾病、过敏反应和动脉粥样硬化的药物，并能帮助促进健康细胞的发展、钙的吸收和正常组织的生长。在制造果汁和饮料时，AA 也作为一种抗氧化剂使用。因此，AA 的检测对制药、临床和食品工业均具有重要意义[26].目前检测AA 的方法主要有电化学方法[27]、化学发光法[28]、高效液相色谱法[29]、分光光度法[30]、毛细管电泳法[31]和荧光分析法[32]等。电化学方法由于灵敏度高，是检测 AA 的主要方法。但是，与AA 具有相似还原性质的分子如尿酸（ UA） 和多巴胺（ DA） 对该方法造成的干扰较大，而且 AA 的氧化产物会吸附在电极表面，影响体系的稳定性和重现性。荧光分析法具有简单、方便和快速等优点。因此，本工作以 GQDs 作为荧光探针，建立了基于 GQDs 的荧光猝灭检测 AA 的新方法。
2 实 验。
2. 1 仪器与试剂。
LS-55 型发光光度计（ Perkin-Elmer,USA） ; Cary60 型紫外可见分光光度计（ Agilent Technologies,USA） ; PHSJ-4A 型 pH 计（ 上海精密科学仪器有限公司） ; XW-80A 型漩涡振荡混合器（ 上海医科大学仪器厂） ; TGL-16G-A 型高速冷冻离心机（ 上海安亭科学仪器厂） 等； SZCL-3B 数显智能控温磁力搅拌器（ 巩义市予华仪器有限责任公司） ;78-1 磁力加热搅拌器（ 常州国华电器有限公司） ; BS 110S 电子天平（ 北京赛多利斯天平有限公司） ; FL3-P-TCSPC 时间分辨荧光仪（ HORIBA JOBIN JVON,France） ; JEM-2100F 场发射透射电子显微镜（ JEOL） ; Multimode 8原子力显微镜（ Bruker,USA） .
抗坏血酸（ AA） 、人血清白蛋白（ HSA） 购于美国 Sigma-Aldrich 公司； 多巴胺（ DA） 购于 AlfaAesar 公司； D-色氨酸 （ D-Trp） 、DL-苏氨酸 （ DL-Thr） 、L-α-丙氨酸 （ L-α-Ala） 、L-组氨酸 （ L-His） 、D-丝氨酸 （ D-Ser） 、L-赖氨酸 （ L-Lys） 、L-亮氨酸（ L-Leu） 、L-苯丙氨酸（ L-Phe） 由中国医药（ 集团）上海化学试剂公司提供； 尿酸（ UA） 购于上海生工生物有限公司； 半乳糖（ Gal） 、果糖（ Fru） 、甘露糖（ Man） 购于比利时 Acros Organics 公司； 柠檬酸购于广州化学试剂厂。
实验所用其他化学试剂均为国产分析纯，实验用水为 18. 2 MΩ·cm 的超纯水。
实验所用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液（ 1.0 ×10- 2mol / L,pH 4. 0 ~ 7. 5） : 称取 0. 78 g NaH2PO4·2H2O,溶于 450 mL 超纯水中，定容至 500 mL,用H3PO4和 NaOH 溶液调节 pH 值。
2. 2 人血清样品的预处理。
人血清样品取自桂林市第五人民医院。取200 μL 人血清，置于 1. 5 mL 离心管中，加入 400μL 乙腈，漩涡震荡混合 5 min,在高速冷冻离心机上以 1. 2 ×104r / min 的速度离心 20 min,取上层清液，用氮气吹干，残留物用 1 000 μL 超纯水溶解，试液置于冰箱中 4 ℃保存备用。
2. 3 GQDs 的合成。
GQDs 的合成方法参照文献[33].称取 2. 0g 柠檬酸加入试管中，加热至 200 ℃ ,当柠檬酸全部融化后开始计时。20 min 后，溶液颜色变为橘红色。在磁力搅拌作用下，将橘红色液体用滴管逐滴加入 100 mL 含 10 mg NaOH 的溶液中，用HCl 调节 pH 至 7. 0,得到 GQDs 水溶液，浓度为14 mg / mL,于 4 ℃ 下避光保存。
关 键 词： 石墨烯量子点； 荧光探针； 非标记方法； 抗坏血酸。
Abstract: A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantumdots （ GQDs） was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid （ AA） . The initialstrong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition ofAA. The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDs via the redox re-action of AA and GQDs in weak acid solution. The quenching efficiency was linearly proportional tothe concentration of AA within the range of 5. 0 × 10- 6- 7. 5 × 10- 5mol / L with a low detection limitdown to 1. 0 × 10- 6mol / L. The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experi-mental operations,and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species.Additionally,this method was successfully applied to the determination of AA in biological sampleswith satisfactory recoveries （ 95. 2% - 115. 3% ） .
Key words: graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid.
1 引 言。
石墨烯量子点（ GQDs） 是最近发现的粒径小于 100 nm 具有0 维结构的石墨烯纳米片[1-3].与石墨烯类似，GQDs 也有大的表面积和 π-π 共轭网状结构。作为一种新的碳纳米荧光材料，GQDs由于其优越的光稳定性、优良的光学和电化学性能、高的荧光活性、抗光漂白能力和低细胞毒性[4-8],已经在化学、材料、物理学和生物学领域引起较大关注并成为当前的研究热点之一，目前已用于氯离子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三价铁离子[12]、过氧化氢[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白 G[16]、生物巯基化合物[17-18]、脱氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的检测，以及用于药物释放[21]和生物成像[22-24]等领域。
抗坏血酸（ AA） 是一种重要的抗氧化剂，在人体平衡氧化压力中起重要作用。AA 在人体液中存在的浓度相对较高，例如，人血液中 AA 的浓度为 6 ~ 15 μg/mL[25].AA 是治疗坏血病、药物中毒、肝脏疾病、过敏反应和动脉粥样硬化的药物，并能帮助促进健康细胞的发展、钙的吸收和正常组织的生长。在制造果汁和饮料时，AA 也作为一种抗氧化剂使用。因此，AA 的检测对制药、临床和食品工业均具有重要意义[26].目前检测AA 的方法主要有电化学方法[27]、化学发光法[28]、高效液相色谱法[29]、分光光度法[30]、毛细管电泳法[31]和荧光分析法[32]等。电化学方法由于灵敏度高，是检测 AA 的主要方法。但是，与AA 具有相似还原性质的分子如尿酸（ UA） 和多巴胺（ DA） 对该方法造成的干扰较大，而且 AA 的氧化产物会吸附在电极表面，影响体系的稳定性和重现性。荧光分析法具有简单、方便和快速等优点。因此，本工作以 GQDs 作为荧光探针，建立了基于 GQDs 的荧光猝灭检测 AA 的新方法。
2 实 验。
2. 1 仪器与试剂。
LS-55 型发光光度计（ Perkin-Elmer,USA） ; Cary60 型紫外可见分光光度计（ Agilent Technologies,USA） ; PHSJ-4A 型 pH 计（ 上海精密科学仪器有限公司） ; XW-80A 型漩涡振荡混合器（ 上海医科大学仪器厂） ; TGL-16G-A 型高速冷冻离心机（ 上海安亭科学仪器厂） 等； SZCL-3B 数显智能控温磁力搅拌器（ 巩义市予华仪器有限责任公司） ;78-1 磁力加热搅拌器（ 常州国华电器有限公司） ; BS 110S 电子天平（ 北京赛多利斯天平有限公司） ; FL3-P-TCSPC 时间分辨荧光仪（ HORIBA JOBIN JVON,France） ; JEM-2100F 场发射透射电子显微镜（ JEOL） ; Multimode 8原子力显微镜（ Bruker,USA） .
抗坏血酸（ AA） 、人血清白蛋白（ HSA） 购于美国 Sigma-Aldrich 公司； 多巴胺（ DA） 购于 AlfaAesar 公司； D-色氨酸 （ D-Trp） 、DL-苏氨酸 （ DL-Thr） 、L-α-丙氨酸 （ L-α-Ala） 、L-组氨酸 （ L-His） 、D-丝氨酸 （ D-Ser） 、L-赖氨酸 （ L-Lys） 、L-亮氨酸（ L-Leu） 、L-苯丙氨酸（ L-Phe） 由中国医药（ 集团）上海化学试剂公司提供； 尿酸（ UA） 购于上海生工生物有限公司； 半乳糖（ Gal） 、果糖（ Fru） 、甘露糖（ Man） 购于比利时 Acros Organics 公司； 柠檬酸购于广州化学试剂厂。
实验所用其他化学试剂均为国产分析纯，实验用水为 18. 2 MΩ·cm 的超纯水。
实验所用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液（ 1.0 ×10- 2mol / L,pH 4. 0 ~ 7. 5） : 称取 0. 78 g NaH2PO4·2H2O,溶于 450 mL 超纯水中，定容至 500 mL,用H3PO4和 NaOH 溶液调节 pH 值。
2. 2 人血清样品的预处理。
人血清样品取自桂林市第五人民医院。取200 μL 人血清，置于 1. 5 mL 离心管中，加入 400μL 乙腈，漩涡震荡混合 5 min,在高速冷冻离心机上以 1. 2 ×104r / min 的速度离心 20 min,取上层清液，用氮气吹干，残留物用 1 000 μL 超纯水溶解，试液置于冰箱中 4 ℃保存备用。
2. 3 GQDs 的合成。
GQDs 的合成方法参照文献[33].称取 2. 0g 柠檬酸加入试管中，加热至 200 ℃ ,当柠檬酸全部融化后开始计时。20 min 后，溶液颜色变为橘红色。在磁力搅拌作用下，将橘红色液体用滴管逐滴加入 100 mL 含 10 mg NaOH 的溶液中，用HCl 调节 pH 至 7. 0,得到 GQDs 水溶液，浓度为14 mg / mL,于 4 ℃ 下避光保存。
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