油棕(Elaeisguineensis)俗称油椰子,属棕榈科椰子亚科油棕属,是热带多年生单子叶木本油料作物。油棕平均年产棕榈油4.17t/hm2,一些高油品种年产量可达16t/hm2,是其他油料作物(油菜、大豆、花生)年平均单产的6~20倍,是世界上生产效率最高的产油植物,被人们誉为“世界油王”[1]。
成熟的油棕果呈棕红色,其中含有大量的类胡萝卜素[1-2]。叶黄素(lutein)、番茄红素(lycopene)、α-胡萝卜素(α-carotene)和β-胡萝卜素(β-carotene)是油棕果中含量最为丰富的类胡萝卜素,其中80%为α-胡萝卜素和β-胡萝卜素[3]。类胡萝卜素具有清除自由基、增强免疫力、降低癌症发生几率等作用[4],成为目前人们研究的热点。高效液相色谱法是目前最有效的对植物果实中类胡萝卜素进行定量和定性分析的分析方法[5-6]。Mortensen等[7-8]用C30色谱柱对粗提棕榈油进行分析,结果表明40%的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素主要以顺式异构体的形式存在。目前,对油棕果的研究主要集中在棕榈油含量和成分,有关不同成熟期油棕果类胡萝卜素种类与含量及其变化规律的报道较少[6,9]
。因此,笔者采用高效液相色谱法对不同成熟期油棕果中类胡萝卜素含量进行检测分析,考察油棕果发育过程中类胡萝卜素含量的变化规律,以期探索类胡萝卜素的积累与转化规律,为进一步理解油棕果实类胡萝卜素,特别是α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的积累机制、油棕的种植及保健食品及药物开发提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验于2012—2013年在海南大学材料与化工学院重点实验室进行。油棕果实采自中国热带农业科学院椰子研究所,采摘方法参照文献[10]进行。5个不同发育时期分别命名为G1、G2、G3、G4、G5,其中G1、G2、G3、G4、G5分别为授粉后约10、45、90、135、180d[11]。新鲜油棕果采摘后―70℃保存备用。
仪器主要有美国Waters2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器、CR-22GⅡ日立离心机、分度吸量管、梨形分液漏斗等。β-胡萝卜素标准品(分析标准品)、α-胡萝卜素标准品(分析标准品)、蕃茄红素标准品(纯度98%)、叶黄素标准品(纯度90%)均购于上海源叶生物科技有限公司。丙酮(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)均购于天津市化学试剂一厂。乙腈、甲醇、二氯甲烷均购于Sigma公司进口分装色谱级试剂;无水硫酸钠、氯化钠均购于广州化学试剂厂分析纯试剂。试验用水为去离子三重蒸水。
1.2试验方法
1)油棕类胡萝卜素的制备。取冷冻保藏的不同时期油棕果解冻后,用蒸馏水洗净,用小刀切下油棕果肉,称取10g放到研钵里,加入20mL丙酮研磨成匀浆,倒入离心管,再加入10mL氯仿继续研磨成匀浆,倒入离心管中,最后用10mL10%NaCl溶液洗涤研钵,合并滤液和果浆,并用玻璃棒搅拌混匀,在15℃8000r/min离心20min,收集滤液和氯仿相转入有盖试管中,残渣和油棕果浆加5mL氯仿提取,重复2次直至果肉浆无色,再次15℃8000r/min离心20min,合并2次滤液和氯仿相,15℃8000r/min离心20min。将滤液转入梨形分液漏斗,静置30min,分层后用50mL三角瓶收集下层(氯仿相),再加入10mL氯仿到梨形分液漏斗进行萃取,并充分振摇,静置10min,完全分层后,收集下层(氯仿相),弃去上层(水相),最后在50mL三角瓶加入适量的无水硫酸钠遮光干燥30min。
2)不同成熟期油棕果中类胡萝卜素的测定。
①标准品的配制。分别称取一定量β-胡萝卜素标准品、蕃茄红素标准品、叶黄素标准品用色谱级流动相定容至50mL,分别配成308、10、272μg/mL。分别取β-胡萝卜素标准品溶液、蕃茄红素标准品溶液、叶黄素标准品溶液1、2、1mL混匀(其质量浓度分别为β-胡萝卜素标准品77μg/mL、蕃茄红素标准品5μg/mL、叶黄素标准品68μg/mL),根据高效液相色谱图,测出相应物质的峰面积。
②样品的配制。将提取液溶于色谱级流动相条件(V乙腈∶V甲醇∶V样液=50∶15∶35),定容至100mL,即不同时期油棕果中类胡萝卜素高效色谱法的样液。
③色谱条件。高效液相色谱检测器为二极管阵列检测器(PAD),色谱柱:X-BridgeC18(250mm×4.6mm,粒径5μm);流动相为V乙腈∶V甲醇∶V二氯甲烷=85∶13∶2;流速1.0mL/min;柱温30℃,取10μL油棕类胡萝卜素提取液进样;450nm波长处检测。记录保留时间及各组分的光谱图与标品对照定性。
1.3统计分析
对HPLC得到的色谱图,用岛津公司的Class-vp软件转化为峰面积,按外标法定量。用Excel进行方差分析。
2 结果与分析
2.1不同成熟期油棕果类胡萝卜素高效液相色谱
1)标准品高效液相色谱图。叶黄素标准品、蕃茄红素标准品和β-胡萝卜素标准品溶液混合后高效液相色谱见图1。3种物质主峰保留时间分别为3.233、13.871和25.902min,按质量浓度分别为68、5和77μg/mL上样,对应的峰面积分别是25439、20839和117369。
2)不同成熟期类胡萝卜素高效液相色谱图。5个发育时期油棕果按本文“1.2.1)”样品处理方法,在选定的液相色谱条件下进样,测定其主要的类胡萝卜素物质与含量(图2)。5个时期均能获得类胡萝卜素各组分良好的分离效果。根据叶黄素、蕃茄红素和β-胡萝卜素3种标准品的保留时间,得到这3种物质在5个时期中的主峰,除了G2时期未能检测到番茄红素外,其他时期均有该类物质。经过计算,分别得到各物质的绝对含量和相对含量(表1)。由于α-胡萝卜素标样难以制备和购得,根据文献[12]中α-胡萝卜素在选定的液相色谱条件下的保留时间,推断出油棕果类胡萝卜素HPLC谱图中α-胡萝卜素的主峰。在5个时期中α-胡萝卜素主峰的出峰时间均在21.129~23.030之间(图2)。
除此之外,5个时期均发现其他类胡萝卜素物质。每个时期的峰数不尽相同。有意思的是,G1-G3时期HPLC谱图形相似;而G4和G5时期HPLC谱图形相似。G1-G3时期HPLC谱图中,峰数主要集中在出峰时间较早的位置,且随着成熟时期增加而峰数逐渐减少。
2.2不同成熟期油棕果类胡萝卜素主要组分含量的变化
根据3次HPLC谱图中叶黄素、番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素4种主要组分的含量,取平均值(表2)。油棕果中叶黄素的含量呈现逐渐减少的变化趋势。
G1时期含量最高,在前3个时期(G1-G3)持续较高表达;G4时期开始明显下降,至G5时期,含量变化不大。番茄红素的变化没有表现出线性化的规律。除了G2时期未检测到番茄红素外,其他4个时期均有,其中G4时期最高;其次为G1和G5,含量减少了约1/3。作为类胡萝卜素最重要的成分之一,α-胡萝卜素在油棕果中含量变化相当明显。前3个时期其含量都在100μg/g左右,后2个时期则迅猛升高,到G5时期,含量达10000μg/g。
β-胡萝卜素在油棕果中的含量变化与α-胡萝卜素非常相似,G1-G3含量较低,变化不大,G4和G5时期含量陡然增加,在G5时期达到最高值。
3讨论
类胡萝卜素提取的充分和溶解状态,直接影响后续HPLC分析效果,影响组分的分离和获得。类胡萝卜素种类繁多,它们之间极性差异较大,提取分离过程中多易降解,使得类胡萝卜素的提取采用单一有机溶剂提取通常不能达到良好的效果。目前,油棕果类胡萝卜素提取分离方法未见报道。为了能获得更多的分离组分,我们分别采用6种不同有机溶剂配比的提取方法,提取液进行HPLC检测,摸索建立针对油棕果中类胡萝卜素的分离技术。第1种用V乙酸乙酯∶V丙酮=1∶1,可从不同成熟期油棕果中可分离出6种组分;第2种采用V丙酮∶V乙酸乙酯∶V乙醇=1∶1∶1混合液,可分离出5种类胡萝卜素;第3种则用V乙酸乙酯∶V丙酮=2∶1混合液和10%NaCl,可获得出8种组分;第4种为V正己烷∶V丙酮=2∶1混合液可分离出11种组分;第5种为V乙酸乙酯∶V丙酮=1∶2,混合液和2mL6%KOH-甲醇溶液皂化,虽可有效除去叶绿素和油脂类物质,将类胡萝卜素酯水解成为游离态的类胡萝卜素,但皂化会造成类胡萝卜素总含量和单个类胡萝卜素组分不同程度的损失,同时这些物质还会影响色谱的分离,缩短色谱柱的寿命;第6种用丙酮、氯仿和10%NaCl分别处理,可从油棕果中分离出大约18种组分。由此可见,第6种提取方法有望获得较丰富的类胡萝卜素分离组分。
由图2A-E的峰型可看,油棕类胡萝卜素各物质其含量在5个时期的发育过程中有2个明显的分界:G1-G3;G4-G5。
G1-G3中,主要存在是极性大的物质,且极性程度接近。
G4-G5中,极性较大的物质含量极少,极性较小的物质均匀分布。分析5个时期类胡萝卜素主要组分的总峰高和总峰面积,可推断类胡萝卜素总含量。可见,从G1到G5,类胡萝卜素总含量上升,尤其是G4期之后。对叶黄素、蕃茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素含量变化进行分析后发现,与其他极性较大的物质含量变化相一致,叶黄素的含量随着油棕成熟度的增加而减少,而蕃茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素含量逐渐增加。极性居中的蕃茄红素的变化不是很明显,极性相对较小的α-胡萝卜素、β-胡萝卜素的含量急剧上升。油棕果发育过程包含了前期细胞快速增殖和后期脂肪积累两个过程。由此可见,在前期极性大的物质参与了细胞快速增长过程,这一过程脂肪积累相当少。待细胞发育到一定大小,果实内部才逐渐开始调控脂肪的堆积。在后期(G4和G5)脂肪堆积过程中,类胡萝卜素在酶的作用下不断转化为以α-胡萝卜素和β-胡萝卜素,特别是β-胡萝卜素(大约是α-胡萝卜素的3~4倍)为主要形式。
β-胡萝卜素占成熟期类胡萝卜素总量的60%以上,这也是成熟油棕果外在特征(橙红色)的体现。油棕果成熟过程中类胡萝卜素的变化主要是β-胡萝卜素的积累过程。
