大丽花(Dahliapinnata)原产于墨西哥、危地马拉及哥伦比亚一带，是菊科大丽花属的多年生球根草本花卉，花期长，色彩绮丽，具有极高的观赏价值．目前对大丽花的研究主要集中在栽培技术、花芽分化、品种资源与分类、组织培养技术、突变体和病虫害防治等方面，对大丽花在水分胁迫下反应机理方面的研究尚未见报道．干旱是影响植物分布和生长发育的主要环境因子之一，其危害程度在诸多非生物胁迫中占首位．全球有三分之一以上的土地位于干旱半干旱地区，其他地区在作物生长季节也发生不同程度的干旱，其实质是植物缺水，即干旱胁迫．研究表明，植物在逆境下(如干旱)会引起膜伤害和膜透性的增加，以及生物自由基的累积，而植物体内一系列的抗氧化酶类和小分子物质可以清除这些活性氧自由基，即植物对不良环境的适应性反应．因此，研究干旱胁迫下植物体内抗氧化酶类活性及渗透调节物质含量的变化，是了解植物在长期进化过程中所演化出适应干旱的机制和策略的重要基础．本研究分析了干旱胁迫下大丽花品种‘粉西施’叶片生理生化指标及抗氧化酶活性的变化，以期为今后的栽培应用及抗性品种的选育提供基础数据，为大丽花抗旱种质的改良、创新等研究提供理论依据．
1、材料与方法
1.1试验材料
试验于2010年7－8月在山东省果树研究所观赏园艺室实验室进行．供试材料为大丽花品种‘粉西施’，4月底在山东省果树研究所苗圃扦插育苗，扦插苗长到15cm时，选取生长健壮、长势一致的扦插苗于7月定植于塑料容器中，容器上口径28cm、高30cm，每盆装基质(壤土∶草炭∶沙土=5∶3∶2)共10kg，进行正常栽培管理．
1.2试验方法
1.2.1试验设计2010年7月底进行水分胁迫，每盆充分灌溉，使土壤含水量一致，停止灌溉后等土壤自然落干进行干旱胁迫，测定的田间持水量为28.2%．试验共设4个土壤水分处理:1)正常水分处理，田间持水量的75%～80%(对照，CK);2)轻度干旱胁迫，田间持水量的55%～60%(LD);3)中度干旱胁迫，田间持水量的40%～45%(MD);4)重度干旱胁迫，田间持水量的30%～35%(SD).每处理10盆，每盆1株．每天18:00采用称量法控制水分，在胁迫开始后的3d、6d、9d、12d、15d和18d(第15天采样后进行复水)，每处理选取新梢3～5节位的成熟叶片，采样后放入冰壶中，迅速带回实验室进行相关指标的测定．
1.2.2测定方法叶片相对含水量采用烘干称量法测定;叶片水势采用小液流法测定;叶绿素含量采用丙酮浸提法测定;叶片电解质渗透率采用电导仪法测定;叶片丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定;叶片脯氨酸含量采用磺基水杨酸提取茚三酮显色法测定;叶片可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定;叶片可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定;叶片SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定;叶片POD活性采用愈创木酚法测定;叶片CAT活性采用紫外分光光度法．UV-2450型紫外可见分光光度计测定吸光值，测定均重复3次．
1.3数据处理
采用SPSS17.0统计软件进行数据统计，用单因素方差分析(one-wayANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同处理组数据的差异，用Pearson相关系数评价不同指标间的相关关系．
2、结果与分析
2.1干旱胁迫下粉西施叶片水势和相对含水量的变化
由表1可以看出，随着时间的延长和胁迫程度的加深，粉西施叶片水势降低．各水分胁迫处理条件下，粉西施叶片水势均显著小于对照，重度胁迫下叶片水势较对照的降幅(1.04～1.56MPa)高于轻度(0.25～0.73MPa)和中度胁迫(0.79～1.21MPa)．复水后3d，轻度与中度胁迫下叶片水势差异不显著，接近对照水平(较对照分别低0.15和0.17MPa)，重度胁迫下的叶片水势显著小于对照水平(较对照低1.54MPa)．随着时间的延长和胁迫程度的加深，粉西施叶片相对含水量逐渐降低．水分胁迫初期(6d)，轻度胁迫下，粉西施叶片相对含水量与对照的差异不显著，中度和重度胁迫下显著小于对照．胁迫后期(12～15d)，中度和重度胁迫显著小于对照，轻度与中度胁迫差异不显著，中度与重度胁迫差异不显著．复水后，轻度和中度胁迫条件下的叶片相对含水量升高，对照和重度胁迫条件下降低．轻度胁迫下，粉西施叶片相对含水量与对照差异不显著，中度和重度仍显著小于对照．
2.2干旱胁迫下粉西施叶片叶绿素含量的变化
由表2可以看出，随着时间的延长和胁迫程度的加深，粉西施叶片中叶绿素含量不断降低，而对照水平的叶绿素含量下降幅度较小．水分胁迫下粉西施叶片叶绿素含量为轻度胁迫＞中度胁迫＞重度胁迫．复水后，轻度胁迫下，大丽花叶片叶绿素含量逐渐升高，与对照差异不显著;中度和重度胁迫下，叶绿素含量均显著小于对照．
2.3干旱胁迫下粉西施叶片相对电导率和丙二醛含量的变化
由表2可以看出，粉西施叶片相对电导率和MDA含量在胁迫期间随着时间的延长逐渐升高，均高于对照，增加幅度依次为重度胁迫＞中度胁迫＞轻度胁迫．各胁迫处理叶片相对电导率和MDA含量均显著高于对照．复水后，轻度和中度胁迫条件下，叶片相对电导率和MDA含量逐渐降低．轻度胁迫下，叶片相对电导率与对照差异不显著，可基本恢复到对照;中度、重度胁迫虽有所恢复，但仍显著高于对照水平．轻度、中度胁迫条件下，叶片中MDA含量接近对照水平;重度胁迫下MDA含量显著高于对照．
2.4干旱胁迫下粉西施叶片渗透调节物质含量的变化
随着胁迫程度的加深和时间的延长，粉西施叶片中脯氨酸和可溶性糖含量逐渐升高，各胁迫处理的可溶性糖和脯氨酸含量均显著大于对照(表3)．复水后，轻度胁迫下，叶片中可溶性糖含量逐渐降低，各胁迫处理可溶性糖含量差异显著．叶片中脯氨酸含量在中度和重度胁迫下与对照差异显著．由表3可以看出，随着时间的延长和胁迫程度的加深，粉西施叶片可溶性蛋白含量呈降－升－降的变化趋势，胁迫处理条件下叶片可溶性蛋白含量均高于对照．在中度和重度胁迫下，可溶性蛋白含量与对照差异显著．
2.5干旱胁迫下粉西施叶片抗氧化酶活性的变化
由表4可知，随着胁迫程度的加深，粉西施叶片SOD、POD和CAT活性均呈先上升后下降的变化趋势．这说明一定强度的干旱胁迫可使大丽花叶片的抗氧化酶SOD、POD和CAT活性上升;但严重的干旱胁迫可能抑制了SOD、POD和CAT活性，使之降低．粉西施叶片中SOD活性在轻度胁迫下最大，POD和CAT在中度胁迫下活性最大，而在重度胁迫下活性均下降．复水后各胁迫处理条件下SOD活性差异显著，POD活性各胁迫处理差异不显著．CAT活性在中度胁迫下显著大于对照，重度胁迫下显著小于对照，轻度胁迫与对照差异不显著．
2.6干旱胁迫下粉西施叶片各生理生化指标的相关分析
干旱胁迫下粉西施叶片各生理生化指标的相关分析结果表明(表5)，叶片相对含水量与叶绿素含量呈显著正相关，与脯氨酸含量呈极显著负相关，与相对电导率、丙二醛含量和可溶性糖含量呈显著负相关．相对电导率与丙二醛含量、脯氨酸含量均呈显著正相关，与可溶性糖呈极显著正相关，与SOD、POD活性均呈显著负相关．丙二醛含量与可溶性糖、CAT活性均呈显著正相关．POD活性与可溶性糖、SOD活性分别呈显著负相关和极显著正相关．
3、讨论
3.1干旱胁迫对粉西施叶片膜脂过氧化作用的影响
细胞膜具有选择透性，各种逆境伤害都会造成细胞膜选择透性的改变或丧失，导致大量离子外渗，从而使组织浸出液的相对电导率升高．研究表明，植物在遭受水分胁迫时，细胞膜发生过氧化作用而受到损伤，MDA是膜脂过氧化作用的产物之一，是检测膜损伤程度的公认指标．本研究中，随水分胁迫程度的加深，大丽花叶片的MDA含量和相对电导率升高，与叶片相对含水量呈显著负相关，复水后重度胁迫处理仍较对照显著降低，说明在水分胁迫下，植物代谢紊乱发生膜脂过氧化，质膜遭到损害，大量离子外渗，MDA积累．严重胁迫下其损害最严重，复水后无法恢复到对照水平，说明质膜损害难以恢复．
3.2干旱胁迫对粉西施叶片渗透调节物质的影响
植物受到环境胁迫时，植物体内游离脯氨酸积累增加，在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动．植株体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植株体内的水分状况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标．但是，水分胁迫下植物体内脯氨酸的积累与植物抗旱性的关系颇有争论．有研究认为，可以用脯氨酸的积累来衡量作物的抗旱性．也有一些研究发现，二者之间相关性并不明显．本研究中，水分胁迫下大丽花叶片中脯氨酸含量显著增加，与曹帮华等的研究结果一致．脯氨酸与相对含水量呈极显著的负相关关系，在中度和重度胁迫后期显著增加，说明脯氨酸积累对干旱等渗透胁迫有反应，这与李霞等对黄檗的研究结果一致．植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，在受到干旱胁迫时会发生变化，测定其含量变化是了解植物抗逆性的一种重要方法．研究表明，干旱抑制蛋白质的合成并诱导蛋白质的降解，从而使植株体内的总蛋白质含量降低．葛体达等研究认为，可溶性蛋白质在水分胁迫下下降;李妮亚等认为，在多种逆境胁迫下，植物体内正常的蛋白质合成常会受到抑制，同时会有一些被诱导出的新蛋白出现或原有蛋白质含量明显增加．本研究中，大丽花叶片中可溶性蛋白含量随着胁迫程度的加深先降低后升高，说明水分胁迫抑制了蛋白质的合成，含量升高可能是在胁迫下促进某些特殊种类的蛋白质即“逆境蛋白”或“胁迫蛋白”合成的结果．这与李妮亚等在小麦上的研究结果一致．胁迫末期可溶性蛋白含量减小，可能是胁迫蛋白的调节能力有限，具体机理还有待于进一步探讨．
3.3干旱胁迫与粉西施叶片的保护酶系统
研究表明，SOD、POD和CAT活性与植物抗逆性相关．在适度逆境诱导下，SOD、POD和CAT活性增加，以提高植物适应力．在胁迫试验中，酶活性一般随胁迫增加而增加，或者呈先增加后降低的基本势态．本研究结果表明，大丽花抗氧化酶活性先升高后降低，在一定干旱胁迫范围内，通过增加酶活性来提高适应干旱胁迫的能力．但当胁迫超出其忍耐范围，保护酶活性则会下降，说明大丽花忍耐干旱胁迫的能力是有限的．这与张文辉等在栓皮栎上的研究结果一致．SOD、POD和CAT是细胞内清除活性氧的主要保护酶，对活性氧的清除能力是决定细胞对胁迫抗性的关键因素．整个保护酶系统防御能力的变化取决于这几种酶彼此协调的综合结果．本研究中，在不同程度水分胁迫下，大丽花叶片这几种保护酶活性的变化有所不同．SOD是一种诱导酶，水分胁迫促进超氧阴离子的生成，在轻度胁迫下，诱导了SOD基因的表达，所以活性增加，由SOD歧化超氧阴离子产生的H2O2也必然增多;而在中度和重度胁迫下，植物体内的代谢趋于混乱，从而抑制其基因表达，SOD活性在中度胁迫下开始下降．而清除H2O2的CAT、POD活性在轻度胁迫下均上升，中度水分胁迫下继续升高，重度胁迫才开始下降，表明这3种酶对水分胁迫和活性氧的响应可能存在一定差异，表现为相互协调的作用．SOD、POD和CAT活性能较好地反映植物对逆境的适应能力．POD活性一方面可在逆境或衰老初期表达，清除H2O2，表现为保护效应;另一方面，也可在逆境或衰老后期表达，参与活性氧的生成、叶绿素的降解，并能引发膜脂过氧化作用，表现为伤害效应．本研究结果表明，水分胁迫下大丽花相对电导率与SOD、POD活性均呈显著负相关;MDA含量与二者呈负相关，与CAT活性显著正相关．这说明在水分胁迫下，自由基产生和清除失衡，膜系统发生过氧化反应破坏膜结构，使离子渗透率增大，MDA积累．同时，MDA的积累又抑制了SOD、POD的活性，从而丧失了保护酶系统的功能，促使膜系统受损加重，而CAT可能发生像POD的伤害效应，参与活性氧的生成，引发膜脂过氧化作用．
