黄瓜(Cucumissativus)是我国主栽蔬菜作物之一，其生长发育对水分的要求较高，干旱胁迫是影响黄瓜代谢和产量的重要非生物胁迫因子．有研究表明，干旱胁迫导致植物组织含水量下降、水势降低、质膜透性增大，同时，活性氧大量增加而引起膜脂过氧化、丙二醛(MDA)含量增加、电解质外渗，从而影响植株生长发育．干旱胁迫下，黄瓜幼苗活性氧含量明显积累，MDA、脯氨酸含量逐渐增加，膜质过氧化损伤严重;黄瓜幼苗的叶片相对含水率和净光合速率显著降低，生长受到显著抑制．寻找提高植物抗旱性的方法以及探讨其内在机理对调节植物的生长发育具有十分重要的意义．水杨酸(salicylic acid，SA)是一种内源信号分子，不仅可以诱导植物体内病程相关蛋白基因表达而产生抗病性，而且能够提高植物抗盐性、抗旱性、抗热性等．近年来，关于外源SA通过调节植物多种生理代谢从而提高抗逆性的研究已经取得了一定的进展．有研究表明，外源SA使逆境下植物体内H2O2含量上升，进而诱导相关抗氧化酶基因的表达，提高相关抗氧化酶(SOD、POD、APX等)的活性，从而减轻活性氧(reactive osygen species，ROS)积累带来的伤害，并且诱导多种与胁迫反应有关的基因表达，提高植株抗逆性．SA还能够减少膜脂过氧化产物MDA的积累，降低叶片质膜透性，提高植物体内的ATP含量，为各种物质代谢的正常进行提供充足的能量，从而提高植物抵抗高盐、低温、重金属等环境胁迫的抗性．此外，适宜浓度的SA能够提高植物的光合作用，进而提高生理代谢能力和胁迫适应能力．外源SA能够维持高温、高盐等胁迫下植物叶片中较高的PSⅡ最大光化学效率、PSⅡ潜在活性、光化学猝灭系数和PSⅡ实际光化学效率，对PSⅡ反应中心具有一定的保护作用，在一定程度上促进了净光合速率的提高．目前，关于外源SA提高植物抗旱性的作用机制研究较少．因此，本文以黄瓜幼苗为材料，采用定量浇水模拟不同程度干旱胁迫并结合根施外源SA的处理方法，从膜脂过氧化、水分利用效率及叶绿素荧光参数等角度，研究外源SA在植物抵抗干旱胁迫过程中的生理功能及其作用机理，为SA作为抗旱诱导剂在植物生产上的推广应用提供理论依据．
1、材料与方法
1.1供试材料
2010年4—6月，试验于中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行．供试黄瓜品种为“中农203”，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供．
1.2试验设计
先将黄瓜种子在清水中浸泡2h，然后用5%NaClO消毒10min，再用清水冲洗5遍，于(28±0.5)℃恒温培养箱中催芽．待胚根长出后，挑选萌发一致的种子播于塑料营养钵中，每钵1粒，采用3∶1(V/V)的蛭石和石英砂作育苗基质．再将营养钵放入人工气候箱中，昼夜温度为28℃/18℃，光周期10h/14h，光强300μmol·m－2·s－1，相对湿度70%～85%．待子叶展开后用1/2浓度的Hoag-land营养液(pH6.5)浇灌．播种后20d，幼苗二叶一心时进行干旱胁迫处理．在预备试验的基础上，筛选出SA的最佳浓度为0.1mmol·L－1．处理前，分别以3倍基质饱和含水量的含0.1mmol·L－1SA的1/2浓度Hoagland营养液和不含SA的Hoagland营养液浇一次透水，采用自然干旱和称量法，2d后保持基质相对含水量分别为80%、60%和50%．试验共设6个处理:1)对照(CK):基质相对含水量为80%;2)轻度胁迫(L):基质相对含水量为60%;3)重度胁迫(S):基质相对含水量为50%;4)SA+CK:对照处理下，添加SA;5)SA+L:轻度胁迫下，添加SA;6)SA+S:重度胁迫下，添加SA．试验随机区组设计，3次重复，每处理小区50株．苗期管理采用常规方法，保持各处理小区一致．干旱胁迫后2、4、6、8和10d，每处理取5株测定植株的净光合速率(Pn)和荧光参数．取各处理植株第2片真叶，一部分用于测定电解质渗出率;另一部分液氮速冻后于－80℃冰箱中保存，用于MDA含量的测定;再一部分于105℃下杀青15min后，60℃烘干至恒量，用于脯氨酸含量的测定．
1.3测定方法
1.3.1生长指标的测定胁迫处理后第15天，每处理小区取样5株，用游标卡尺测量幼苗茎粗(子叶节下1cm处的粗度)，用直尺测量株高(基质表面到生长点之间的距离)，用万分之一天平称量植株的鲜质量和干质量，计算植株相对含水量(RWC)=(植株鲜质量－植株干质量)/(植株鲜质量)．
1.3.2MDA和电解质渗出率的测定MDA含量参照El-Tayeb的方法测定，电解质渗出率参照Kuo的电导法测定．
1.3.3脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法测定脯氨酸含量．
1.3.4Pn的测定和水分利用率的计算采用Li-6400便携式光合测定仪(LicorInc，Lincoln，NE，USA)，在测定光量子通量密度(PFD)为600μmol·m－2·s－1下，于胁迫后第2、4、6、8、10天10:00测定黄瓜第2片真叶的Pn和蒸腾速率(Tr)，计算水分利用效率(WUE)=Pn/Tr．1.3.5叶绿素荧光参数的测定采用Li-6400便携式光合仪及荧光叶室(LicorInc，Lincoln，NE，USA)测定真叶叶绿素荧光参数．叶片经过暗适应一个黑夜后设置原初荧光参数，关闭光化学光和远红光，先照射检测光(＜0.05μmol·m－2·s－1)测定叶片的初始荧光(Fo)，再照射7mmol·m－2·s－1饱和强闪光，脉冲0.8s后测得暗适应最大荧光(Fm)，然后将叶片在光下适应1h，当荧光基本稳定时，打开光化学光(光强600μmol·m－2·s－1，蓝光占10%)测定稳态荧光(Fs)和光适应下最大荧光绿素(Fm')，同时打开远红光测得光适应下初始荧光(Fo')．计算出可变荧光Fv、Fv/Fm、ΦPSⅡ、PSⅡ有效光化学效率(Fv'/Fm')、qP和非光化学猝灭系数(NPQ)等指标．其中，Fv=Fm－Fo，ΦPSⅡ=(Fm'－Fs)/Fm'，Fv'=Fm'－Fo'，qP=(Fm'－Fs)/(Fm'－Fo')，qN=(Fm－Fm')/Fm'．1.4数据处理用Excel2003软件对试验数据进行处理，用DPS软件进行方差分析，采用最小显著差异法(LSD)进行多重比较(α=0.05)，用Original软件作图．
2、结果与分析
2.1SA对干旱胁迫下黄瓜幼苗生长的影响
从表1可以看出，干旱胁迫下，黄瓜幼苗的株高、茎粗，以及植株鲜质量、干质量和相对含水量等生长指标均显著低于对照，表明干旱胁迫下黄瓜幼苗的生长发育受到明显抑制．添加SA后，胁迫植株的各生长指标均有不同程度的提高．其中，在轻度胁迫下，添加SA的黄瓜幼苗的株高及植株鲜质量、干质量、相对含水量与未添加SA胁迫处理相比差异均达显著水平;在重度胁迫下，添加SA显著提高了黄瓜幼苗的株高、茎粗和植株相对含水量，说明添加SA可有效缓解水分亏缺对黄瓜幼苗生长的抑制作用．
2.2SA对干旱胁迫下黄瓜幼苗MDA含量和电解质渗出率的影响
MDA和电解质渗出率是反映细胞膜伤害程度的重要指标．从图1可以看出，与对照相比，干旱胁迫导致黄瓜幼苗叶片MDA含量显著上升，而且上升幅度随着胁迫程度的增加和胁迫时间的延长而增大，说明干旱胁迫下黄瓜幼苗叶片的细胞膜受到了不同程度的破坏．添加SA后，胁迫植株的MDA含量与未添加SA胁迫处理相比显著下降，在整个处理期间，轻度胁迫下平均下降了11.7%，重度胁迫下平均下降了10.4%．这反映出SA可以减少黄瓜幼苗叶片中细胞膜脂过氧化产物MDA的积累，缓解干旱胁迫对细胞膜的伤害．电解质渗透率的变化趋势与MDA一致．干旱胁迫下黄瓜幼苗的电解质渗透率与对照相比显著上升，升高幅度随着胁迫程度的增加和胁迫时间的延长不断增大．添加SA显著降低了干旱胁迫下叶片的电解质渗透率，在整个处理期间，轻度胁迫下平均下降了9.45%，重度胁迫下平均下降了14.34%．在整个处理期间，与对照相比，添加SA后，黄瓜幼苗叶片MDA含量和电解质渗出率均分别升高6.6%和5.2%，差异未达显著水平，说明在正常水分条件下，添加适量的SA不会对黄瓜幼苗叶片细胞膜造成伤害．
2.3SA对干旱胁迫下黄瓜幼苗脯氨酸含量的影响
从图2可以看出，干旱胁迫显著促进了黄瓜幼苗叶片脯氨酸含量的积累，重度胁迫下脯氨酸含量上升幅度显著高于轻度胁迫．轻度胁迫下，添加SA促进了脯氨酸的积累，在胁迫第2和4天与未添加SA胁迫处理之间差异达显著水平;重度胁迫下，添加SA后，叶片脯氨酸含量在胁迫第2和4天高于未添加SA胁迫处理，胁迫第2天升高幅度最大，为21.2%，而胁迫后第6、8、10天低于未添加SA胁迫处理．与对照相比，添加SA显著提高了叶片脯氨酸含量，表明在正常水分条件下，外源SA对黄瓜幼苗叶片脯氨酸积累有显著的促进作用．
2.4SA对干旱胁迫下黄瓜幼苗叶片Pn和水分利用效率的影响
光合作用为植物的生长发育提供物质和能量，是植物生长发育的基础，光合性能的变化可以直接反映出干旱胁迫对植物的伤害程度．从图3可以看出，与对照相比，干旱胁迫下黄瓜幼苗叶片Pn显著下降，下降幅度随着胁迫程度的增加和胁迫时间的延长而不断增大，其中，Pn在轻度胁迫下下降了25.2%～52.9%，在重度胁迫下下降了41.3%～73.7%．添加SA可以显著减缓Pn的下降幅度．在整个处理期间，与未添加SA胁迫处理相比，添加SA的Pn在轻度胁迫下增加了15.9%～29.4%，重度胁迫下增加了12.2%～53.4%．水分利用效率是植物消耗单位质量水分所固定的CO2数量，当植物的供水出现紧张时，植物一般趋向于通过调节气孔的开放程度以提高水分利用效率，同时维持较高的光合速率，尤其是环境水分供应出现不足时，植物会尽量降低蒸腾速率来提高水分的利用效率，这是植物对环境的适应特征．从图3可以看出，干旱胁迫后，黄瓜幼苗的水分利用效率整体呈下降趋势．干旱胁迫2～4d，水分利用效率高于同期对照，随着胁迫时间的延长，水分利用效率不断下降．添加SA后，不同程度地提高了黄瓜幼苗的水分利用效率．其中，轻度胁迫下6～10d，添加SA后显著提高了植株的水分利用效率(P＜0.05)，在胁迫第10天表现最突出，提高了7.2%;重度胁迫下，添加SA后植株的水分利用效率在整个处理期间均显著高于未添加SA胁迫处理．此外，在胁迫后2～4d，与对照相比，干旱胁迫处理和添加SA胁迫处理均提高了植株的水分利用效率，其中，胁迫后第2天，添加SA后，轻度胁迫下比对照提高了6.5%，重度胁迫下提高了5.6%．可见，短时间内适度的干旱胁迫有利于黄瓜幼苗的水分利用，而且添加SA对此过程有促进作用，这可能与SA可以减小气孔开度，使蒸腾速率下降有关．
2.5SA对干旱胁迫下黄瓜幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响
从图4可以看出，不同程度的干旱胁迫对黄瓜幼苗PSII产生显著影响．与对照相比，干旱胁迫后PSII最大光化学效率(Fv/Fm)和开放反应中心的激发能捕获效率(Fv'/Fm')均显著下降，而且下降幅度随胁迫程度的增加和胁迫时间的延长不断增大．这说明干旱胁迫使黄瓜叶片光能转换效率下降，导致吸收的光能用于光化学反应的比例降低．与对照相比，黄瓜幼苗的PSII光化学量子效率(ΦPSⅡ)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)和光化学猝灭系数(qP)均显著下降，非光化学猝灭系数(qN)先上升后下降．说明干旱胁迫下，PSⅡ实际光能转换效率和PSⅡ潜在活性受到抑制，直接影响了光合作用的电子传递和CO2的同化过程，过剩的光能以热耗散的方式散失．在整个处理期间，添加SA胁迫处理的Fv/Fm高于未添加SA处理，其中，在轻度胁迫下第10天和重度胁迫下4～10d，二者差异达显著水平;添加SA显著提高了轻度胁迫下4～8d的Fv'/Fm'，而在重度胁迫下的整个处理期间，添加SA后Fv'/Fm'均显著高于未添加SA胁迫处理;处理4～8d，轻度胁迫和重度胁迫下添加SA后Fv/Fo均显著高于未添加SA胁迫处理．说明添加SA提高了干旱胁迫下黄瓜幼苗PSⅡ反应中心原初光能转化效率和PSⅡ潜在活性，而且在重度胁迫下比轻度胁迫表现更明显．在整个处理期间，添加SA胁迫处理的植株ΦPSⅡ均高于未添加SA胁迫处理，在轻度胁迫的第10天和重度胁迫的4～10d，二者差异达显著水平，表明添加SA能缓解干旱胁迫对光反应中心PSⅡ的光抑制．添加SA减缓了胁迫植株qP的下降．在整个处理期间，添加SA轻度胁迫处理的qP均高于未添加SA胁迫处理，在胁迫4～6d，二者差异达显著水平，其中第4天提高幅度最大，为7.0%;重度胁迫下添加SA在胁迫4～10d的qP显著高于未添加SA胁迫处理．添加SA显著降低了轻度胁迫下整个处理期间的qN，以及重度胁迫下处理前期(2～6d)的qN．说明与胁迫处理相比，添加SA在一定程度上降低了非光化学反应的损耗，使胁迫植株吸收的光能更多用于光合作用．
3、讨论
外源物质(SA、ABA、多胺等)可以有效减轻干旱胁迫对植株造成的伤害，如增加植物组织含水量，提高水势，减少膜脂过氧化产物MDA含量，防止电解质外渗等．本研究表明，干旱胁迫下，黄瓜幼苗MDA积累，电解质渗出率增加，而施用外源SA降低了MDA含量及电解质渗出率，说明SA能够在一定程度上缓解干旱胁迫对细胞膜的伤害，并且与轻度干旱相比，重度干旱胁迫下表现更明显．另外，不同浓度的SA作用效果不同．种培芳和杨江山研究表明，较低浓度SA(0～500μmol·L－1)可以降低甜瓜叶片MDA含量，保持细胞的稳定性和活力，当浓度超过500μmol·L－1时，膜脂过氧化作用增强，细胞膜可能受损．刘艳等研究发现，10和100μmol·L－1SA预处理明显减少了干旱胁迫下草莓植株MDA的积累，而1000μmol·L－1SA预处理增加了MDA的积累，加剧了干旱胁迫对细胞膜的伤害．
由此可以推测，外源SA对干旱胁迫下MDA积累的抑制作用与SA浓度以及胁迫强度具有密切关系，低浓度SA在轻度干旱胁迫下作用较强，而高浓度SA在重度干旱胁迫下作用较强．植物体内能够通过酶促和非酶促抗氧化防御系统来清除逆境条件下形成的过量活性氧，以保护细胞免受氧化伤害．SA作为信号分子，可以激活多种与胁迫反应有关的基因启动子，并且通过调节活性氧、抗氧化酶及非酶促抗氧化体系而提高植物的抗逆性．活性氧特别是H2O2的产生被认为是防御胁迫反应信号转导链的一部分，但浓度过高则会造成细胞膜过氧化伤害．本研究中，外源SA降低了干旱胁迫下黄瓜幼苗的质膜氧化程度，减小细胞膜透性，这可能归因于抗氧化能力的提高，这也是增强植株抗旱能力的重要环节．大量的有关外源SA提高干旱胁迫下植物抗氧化能力的研究证实了这一点．例如，经SA预处理积累的H2O2诱导黄瓜幼苗APX和CAT活性上升，进而清除所产生的H2O2;适宜浓度SA预处理可以促进干旱胁迫下草莓活性氧的早期积累，并有效激活保护酶SOD、POD和APX的活性，减小膜脂过氧化损伤程度．而罗英研究表明，SA预处理首先明显降低了凤仙花幼苗叶片CAT和APX活性，之后POD、CAT、APX和SOD活性显著升高，它们的共同作用降低了H2O2浓度，减轻氧化伤害．
另外，本研究中，外源SA促进了黄瓜叶片脯氨酸的积累，可使细胞渗透势降低，增大渗透调节能力，以降低细胞水势，减少水分散失，使组织含水量维持在细胞伤害的临界点之上，并且渗透调节可使细胞维持一个恒定的膨压，从而使和膨压相关的一些生理生化过程能顺利进行，这是植物适应干旱胁迫的一个重要生理机制．水分利用效率是评价干旱胁迫下植物生长的一个综合指标，水分利用效率高，表明固定单位质量CO2所需的水量小，水分生产力高．本研究表明，黄瓜幼苗经过干旱胁迫处理后，叶片水分利用效率在干旱胁迫初期升高，其原因可能是由于黄瓜幼苗在一个相对短暂的干旱胁迫下，通过关闭部分气孔使蒸腾速率下降，减少了蒸腾失水．而后期水分利用效率随着胁迫时间延长和胁迫程度的增大急剧下降，其原因可能是由于在胁迫处理后期，水分亏缺引起的膜脂过氧化作用对叶绿体膜系统造成损伤，导致光合机构受损，光合速率严重下降，从而导致水分利用效率下降，限制幼苗生长．SA能够提高Pn和水分利用效率，进而提高生理代谢能力和胁迫适应能力．Fariduddin等发现，外源SA可以提高胞间CO2浓度、水分利用效率和气孔导度，并认为气孔导度变化可能是Pn提高的主要原因．SA还能够缓解高温强光、盐害等逆境造成的膜脂过氧化对膜系统的氧化损伤，在一定程度上保护了叶片的类囊体膜结构，从而提高Pn．本研究中，添加SA后的胁迫植株叶片水分利用率和Pn大幅度提高，促进幼苗生长．
此时，叶片水分利用效率的提高与Pn的大幅度提高关系密切，并且前期研究表明，外源SA能够诱导气孔关闭，降低气孔导度，从而使蒸腾速率下降，减少了蒸腾作用而导致的水分耗散．另外，添加SA对干旱胁迫下叶片水分利用效率的提高，还与黄瓜幼苗细胞膜的稳定性增大及渗透调节能力的增强密切相关．因为在干旱胁迫下，SA能够使植物的渗透调节物质如脯氨酸等含量增加，降低了细胞水势，使细胞能在干旱环境中取得尽可能多的水分．这些物质多为亲水胶体，对水分子的束缚能力强，使吸收的水分不易通过蒸腾而散失，从而改变了细胞内束缚水与自由水的比例，提高了植物的水分利用效率．环境胁迫对植物Pn的影响是一个复杂的过程．叶绿素荧光动力学能够快速、灵敏、无损伤地反映PSⅡ的状况，是研究植物光合生理方法及植物与逆境胁迫关系的理想探针．本研究表明，干旱胁迫导致黄瓜幼苗叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv'/Fm'、Fv/Fo、qP均下降，其下降幅度随胁迫时间延长和胁迫程度增加而不断增大，而Pn的变化趋势与上述叶绿素荧光参数变化趋势一致，说明在干旱胁迫下，PSⅡ最大光化学效率与PSⅡ实际量子产量的下降，导致PSⅡ反应中心的电子传递受阻，从天线色素捕获的光能用于光化学反应的份额减少，PSⅡ反应中心的光化学活性降低，最终导致Pn的下降．添加外源SA后，胁迫植株的Pn、Fv/Fm、ΦPSⅡ、Fv/Fo、Fv'/Fm'、qP均显著提高，qN下降并维持在一个较稳定的水平，说明SA能够减缓干旱胁迫对PSⅡ反应中心的破坏，使黄瓜叶片在干旱胁迫下保持较高的PSⅡ光化学效率，qN下降还说明SA将吸收的光能更多用于光合作用，减少用于非光化学耗散，提高光合效率．
这与高温强光下黄瓜叶片荧光参数的变化相似，即在强光胁迫下，SA通过提高抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化产物的积累，减轻了氧化损伤，维持较高的Fv/Fm、Fv/Fo、qP和ΦPSⅡ，对PSⅡ反应中心具有一定的保护作用．这可能是由于外源SA使CO2同化力升高，叶绿体中ATP和NADPH需求增加，促使PSⅡ潜在活性中心活性及光合作用原初反应的增强，使整个电子传递链的电子传递速度加快，并且LHCⅡ进行蛋白磷酸化后，能在类囊体膜中横向迁移，通过改变PSⅠ与PSⅡ的捕光截面，调节激发能在PSⅠ与PSⅡ之间的分配，达到平衡状态，进而促进Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP升高，降低qN．这是外源SA提高干旱胁迫下光合作用的可能机制之一．综上所述，添加外源SA降低了干旱胁迫下黄瓜幼苗叶片的膜脂过氧化程度，通过增强PSⅡ反应中心活性提高了Pn，进而有利于水分的利用，同时增加渗透调节物质脯氨酸的含量，增大渗透调节能力，来降低细胞的水势，减少水分的散失，提高水分利用效率，从而增强植株对干旱的适应能力．
