测定拮抗细菌Ljb-2对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果

　　由双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellow leaf curl virus，简称 TYLCV）引起的番茄黄化曲叶病毒病（Tomato Yellow Leaf Curl Disease，简称 TYLCD）是目前番茄上的重要病害。该病毒通过烟粉虱传播，1939 年在以色列首次报道，1959年在约旦大面积爆发，1964 年被正式命名（Cohen & Harpaz，1964）。20 世纪 80 年代，该病害在非洲、美国、加勒比地区、欧洲、中东、东南亚等多个国家出现（Picó et al.，1996；Moriones &Navas-Castillo，2000；Varma & Malathi，2003），近年来在世界范围内大爆发，严重危害番茄种植业，已成为全世界番茄生产的主要限制因素之一（Duffy & Holmes，2007；Hanssen et al.，2010；Lefeuvreet al.，2010）。

　　TYLCD 具有爆发突然、扩展迅速、为害性强、防治难度大的特点，除危害番茄外，还可以危害辣椒、烟草、南瓜和菜豆等多种经济作物及部分杂草（Morilla et al.，2005；Díaz-Pendón et al.，2010；李廷刚和李长松，2011）。1995 年该病传入中国（蔡健和 等，1995），2000 年以来已在浙江、重庆、广东、广西、云南、上海、山东、河南等地相继发生（Zhou et al.，2001；龚一帆，2009）。

　　培育抗病品种尽管是最快速有效的方法，但是由于其遗传机理及背景的复杂性，很难培育出抗性稳定的品种，目前生产上主要使用的抗病品种有‘浙粉 701’、‘欧冠’、‘宝丽’、‘齐达利’、‘迪芬妮’等，这些品种多为含有 1 个抗 TY 基因的品种。其中‘迪芬妮’由先正达公司研发，其抗性基因为TY-1，是一种中抗品种。同时由于抗病品种种子价格较贵，一般农民没有购买能力，因此限制了该品种的推广应用（Lapidot & Friedmann，2002；Ji et al.，2007）。另一方面，人们也在使用一些杀虫剂用于防治传播媒介烟粉虱，但是化学农药不但不利于环境的可持续发展，同时由于大量杀虫剂的使用导致烟粉虱产生抗药性（Moriones & Navas-Castillo，2010）；而利用番茄自身抗性是综合防控番茄黄化曲叶病的关键途径，在这方面，利用拮抗菌诱导番茄植株产生对 TYLCV 的抗性是很有前景的发展方向。

　　拮抗菌是一类具有防病促生作用的有益微生物，可以从植物多个生境中分离得到。已有大量研究报道了将拮抗菌引入植物可提高植物的抗病、抗虫、抗逆性（Li et al.，2011；Niu et al.，2011；Wang et al.，2012）。由于拮抗菌在抑制植物病害方面的广谱性、高效性以及安全性，目前成为农药市场发展的趋势，被称为是最有潜力的发展方向。但到目前为止，国内外只有少量报道对 TYLCV有显著抑制效果的拮抗菌，同时也没有能有效防治 TYLCD 的生物农药。

　　作者前期从江苏连云港 TYLCV 发病严重的番茄田块中分离了 857 株细菌，通过一系列的菌株产酶活性测定、指纹图谱聚类分析及温室和田间试验，筛选出对 TYLCV 具有显著抗性的拮抗细菌Ljb-2。

　　本研究中将拮抗细菌 Ljb-2 配合具有一定抗性的抗病品种‘迪芬妮’用于田间试验，测定了该菌株对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果，并对其增产作用、增加叶片叶绿素含量和改善番茄品质方面进行了评价，以期建立以生物防治为核心的 TYLCD 防控技术体系，减少化学农药的使用，提高农产品产量和品质，保障蔬菜产业的可持续发展。

　　1、 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 番茄（Solanum lycopersicum）栽培品种

　　感病品种‘格瑞斯’、中抗品种‘迪芬妮’、高抗品种‘苏粉 12’。

　　1.1.2 菌株

　　成团泛菌（Pantoea agglomerans）Ljb-2 菌株，分离于江苏连云港 TYLCV 发病严重田块中健康番茄植株茎围，具有产蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、葡聚糖酶及嗜铁素活性，通过前期在试验室内一系列的筛选试验发现该菌株对 TYLCV 具有一定抗性。

　　1.1.3 培养基

　　LB（Luria-Bertani）培养基（王春娟 等，2012）。

　　1.2 成团泛菌 Ljb-2 发酵液的制备

　　于-70 ℃超低温冰箱取出 Ljb-2 菌株，迅速在 LB 固体培养基上划线，置于 28 ℃生化培养箱培养 16 ~ 18 h，待长出单菌落后，挑取单菌落接种到含有 5 mL LB 液体试管中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养，当 OD 值达到 0.8 时停止培养，作为种子液。以 1%的接种量将种子液接种至 LB 培养液中，30 ℃、200 r · min-1培养 48 h，采用滴液法检测活菌的浓度。

　　1.3 成团泛菌 Ljb-2 防治 TYLCD 的温室试验

　　选用番茄感病品种‘格瑞斯’4 ~ 5 叶期的温室苗进行试验。设置 1 个成团泛菌 Ljb-2 处理，1个对照处理，每处理 24 株苗，3 个重复。移栽当天每株苗用 30 mL 浓度约为 5 × 107cfu · mL-1的菌液灌根处理，同时用相同浓度菌液（按照 0.01%的终浓度加入表面活性剂吐温-20）均匀喷雾于番茄叶片，以后每 10 d 处理 1 次，共处理 3 次。对照使用等量 LB 培养液处理。植株移栽 7 d 后接种病毒。接种方法为：将无毒烟粉虱在表现 TYLCD 症状的番茄植株上饲养 48 h，然后将待接种的健康植株移至粉虱棚内，每株番茄 30 头左右，接种 3 d 后使用吡虫啉除去烟粉虱，将植株移至防虫温室（28 ℃，16 h/8 h 光周期，70%相对湿度）中（Sade et al.，2012）。番茄开始发病时统计病情，之后每天统计 1 次，待空白对照病害严重度达到 100%时停止统计。

　　1.4 成团泛菌 Ljb-2 防治 TYLCD 田间试验

　　田间试验在江苏省连云港市赣榆县 TYLCD 常发地分两个季度完成。2012 年 4-8 月，试验地大约 670 m2，番茄品种为 TYLCV 感病品种‘格瑞斯’，包括成团泛菌Ljb-2 处理及清水对照处理。2012 年 7-12 月，包括番茄 TYLCV 中抗品种‘迪芬妮’成团泛菌 Ljb-2 处理和清水对照处理、感病品种‘格瑞斯’对照处理及高抗品种‘苏粉 12’对照处理。试验地共划分为 12 个小区，每处理 3 个小区，每小区面积约 60 m2，各处理完全随机区组排列。

　　两次试验均在番茄移栽时进行菌液终浓度为 5 × 107cfu · mL-1喷雾和灌根处理，灌根处理用量为 50 mL · 株-1，喷雾时以菌液在叶片上不下滴为度。对照处理采用清水喷雾和灌根。每 15 d 处理 1次，共计 4 次。待发病后调查发病情况，计算病害严重度及防治效果。

　　TYLCD 病情指数分级标准（Friedmann et al.，1998，Lapidot et al.，2006）：0 级，无症状；1级，顶部叶片轻度黄化，叶边缘轻度卷曲，花期花轻度脱落；2 级，顶部叶片中度黄化，叶边缘中度卷曲褶皱，花期花轻度脱落，结果期产量轻度减产；3 级，叶片严重黄化，卷曲，褶皱，花期花中度脱落，结果期产量中度减产；4 级，大面积叶片严重畸形缩小，植株生长缓慢，明显矮化，花期花严重脱落，结果期产量严重减收或绝产。

　　病害严重度（%）= [∑（发病植株数 × 病级数）/（总植株数 × 最高病级数）] ×100。
　　生防效果（%）= [（对照病害严重度平均值-处理病害严重度平均值）/ 对照病害严重度平均值]× 100。

　　对 2012 年秋季的田间试验番茄叶片叶绿素含量、番茄生长量、果实产量及品质进行测定。当番茄对照处理开始出现症状 5 d 后，对每小区采用 5 点取样法采集植株顶部叶片，每点 3 株，参照曾建敏等（2009）和杨敏文（2002）的方法测定叶绿素的含量。当番茄定植 15 d 后统计植株的株高、茎粗及叶片数，对每小区采用 5 点取样，每点 5 株，每个小区共调查 25 株。在番茄收获期统计每株番茄的果实穗数，对各小区番茄产量累计测产，每次采摘时统计每小区番茄果实的质量、个数，计算增产率，最后将小区产量折算成总产量。在果实成熟期对番茄的品质进行分析。每小区取第 3 穗同一熟度的果实 5 个，用 2,6-二氯靛酚滴定法测定维生素 C 含量；用蒽酮比色法测定可溶性糖含量；用氢氧化钠标准滴定法测定可滴定酸含量（李合生，2000）。每个处理 3 次重复。

　　试验数据在 Microsoft Excel 中进行基本处理后，用 DPS 7.05 软件进行单因素方差分析，并用LSD 法比较各处理间的差异显著性（P = 0.05）。

　　2、 结果与分析

　　2.1 成团泛菌 Ljb-2 对 TYLCV 的防治效果

　　温室条件下番茄感病品种‘格瑞斯’经烟粉虱接种病毒 14 d 后，对照植株开始发病；25 d、35 d后，成团泛菌 Ljb-2 对 TYLCV 的防效分别为 56.81%、49.48%。25 d 时，成团泛菌 Ljb-2 处理植株发病率为 62.5%（图 1），显著低于对照；35 d 时，处理和对照植株发病率接近 100%（表 1）。

　　2012 年春季田间的试验中（表 2），由于温度较低，不利于 TYLCD 自然发病，番茄番茄感病品种‘格瑞斯’定植 40 d 才开始发病，50 d 时成团泛菌的防治效果为 57.12%。

　　2012 年秋季田间试验中（表 3），番茄定植 40 d 后中抗品种‘迪芬妮’开始发病，成团泛菌 Ljb-2处理后显著降低 TYLCD 的病害严重度。定植 50 d 时，‘迪芬妮’对照的病害严重度为 20.31%，成团泛菌 Ljb-2 处理的防效达到 50.76%，定植 60 d 时，其防效仍为 45.26%，且高抗品种‘苏粉 12’与成团泛菌 Ljb-2 处理相比，其病害严重度差异不显著，而感病品种‘格瑞斯’发病相对最重。

　　2.2 成团泛菌 Ljb-2 对番茄的促生和增产作用

　　调查发现，番茄定植 15 d 后，成团泛菌 Ljb-2 对番茄植株的地上部分生长具有显著的促进作用（表 4），‘迪芬妮’品种的株高、茎粗及叶片数均显著高于其对照。番茄移栽 60 d 时统计发现，成团泛菌 Ljb-2 处理后，番茄植株的果穗数和产量均高于其对照（表 4），其增产率为 20.05%。同时高抗品种‘苏粉 12’的产量显著低于中抗品种‘迪芬妮’，说明番茄高抗品种虽然对 TYLCV 具有较高的抗性，但是其产量不高。

　　2.3 成团泛菌 Ljb-2 对番茄叶片叶绿素含量的影响

　　如表5所示，‘迪芬妮’品种对照的叶片中叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别为1.42 mg · g-1、0.89 mg · g-1、2.31 mg · g-1，而成团泛菌 Ljb-2 处理分别增加了 8.5%、15.6%、10.8%。同时，‘迪芬妮’Ljb-2 处理与高抗品种‘苏粉 12’的叶绿素含量差异不显著，而感病品种‘格瑞斯’的叶片叶绿素含量最低，这可能与其植株的病害严重度较大有关。

　　2.4 成团泛菌 Ljb-2 对番茄品质的影响

　　由表 6 可知，Ljb-2 在改善番茄品质方面具有显著的效果。相对于‘迪芬妮’对照，成团泛菌Ljb-2 处理显著提高了番茄维生素 C 含量、可溶性糖含量及可滴定酸含量，并显著增加番茄的糖酸比。

　　3、 讨论

　　目前有关于 TYLCV 生物防治的报道很少。丁雪玲等（2013）利用蜡质芽孢杆菌 3BY4 和肠杆菌 BQ9 防治 TYLCV，田间防治效果分别为 47.03%和 42.76%，同时番茄表现出一定的增产效果，说明使用生物防治的方法防治 TYLCV 具有一定的应用前景。

　　本试验在 2012 年春季大田试验中，番茄定植 50 d 时，拮抗细菌 Ljb-2 对感病品种‘格瑞斯’的防效为 57.12%，而对中抗品种‘迪芬妮’的防效为为 50.76%，说明 Ljb-2 对 TYLCV 的防治效果表现出品种差异性。同时，在 2012 年秋季温室及田间条件下，Ljb-2 对 TYLCV 的防效随着时间的推移表现出下降的趋势，这可能是因为只在试验初期使用了 1 次 Ljb-2 处理，后期随着植株抗性逐渐减弱，同时植株体内病毒逐渐增多，导致其病害严重度增加。因此下一步的工作是选取园艺性状较好的多个番茄品种进行防病检测试验，同时加强生防菌剂在田间的使用条件和使用技术的研究工作。

　　TYLCV 侵染番茄植株后可引起组织中叶绿体病变，叶绿素含量受到影响。张永平等（2009）研究发现，番茄被 TYLCV 侵染后，叶片组织中叶绿素 a、叶绿素 b、总叶绿素含量与健康对照相比分别降低了 32%、26%、30%。于力等（2011）报道 TYLCV 侵染后番茄叶片净光合速率和气孔导度表现出下降趋势。本研究中发现，成团泛菌 Ljb-2 处理后能显著增加叶片叶绿素 a、叶绿素 b 及总叶绿素含量。这可以促进植株光合作用，从而为植株提供激发和保持防卫反应所需的能量（Bolton，2009）。

　　近年来随着番茄的大面积种植出现很多问题（杨悦俭 等，2011；张春奇 等，2011），比如，田兆丰等（2013）评估了 20 个生产上常用的番茄栽培品种对 TYLCD 的抗病性鉴定，结果发现只有 5个品种表现出高抗，其余品种均只有不同程度的耐病性。这些抗病品种都达不到预期的效果，不能从根本上解决 TYLCD 的防治问题。本试验中利用具有一定抗性的成团泛菌 Ljb-2 配合番茄中抗品种‘迪芬妮’，收到较好的防治效果，其防效为 45.26%，接近高抗品种‘苏粉 12’的防治水平，但‘迪芬妮’的产量远远高于‘苏粉 12’，因此，成团泛菌 Ljb-2 结合中抗品种‘迪芬妮’的使用，具有较好的发展潜力。