多种表面修饰方法被用于拓展IONPs在免疫检测中的应用[10,34~36]. 右旋糖酐修饰改善了IONPs生物相容性, 促进其替代HRP应用在ELISA中, 实现了对乙肝病毒表面抗原以及心肌梗死标志物心肌肌钙蛋白I的检测[6]. 壳聚糖修饰使IONPs具有如下优点: 在水溶液中易于分散; 表面大量氨基基团易于交联抗体; 高饱和磁化强度有利于捕获、分离以及富集抗原, 外源磁场去除后团聚体可以重新分散在溶液中,因而成功应用于抗原的捕获及免疫检测[34]. Wu等人[35]在IONPs表面修饰二巯基丁二酸并将其应用于IHC检测.
IONPs催化活性源于并限于颗粒表面的铁原子(Fe2+, Fe3+), 如果与其他具有过氧化物酶样活性的材料结合制备复合纳米材料, 将拓展催化活性的来源,提高单纯IONPs催化效率, 扩展其在免疫检测中的应用[27,37~39]. 转铁蛋白受体1(TfR1)在肿瘤组织广泛表达, 并与肿瘤恶化程度成正相关性, 是肿瘤治疗诊断的常用定位标记物. 类似于TfR1抗体以及天然铁蛋白, 铁蛋白重链(HFn)能够通过配体/受体作用识别并结合TfR1. 如果预先将显色物质与HFn交联, 利用HFn靶向TfR1的特点能够可视化识别肿瘤组织. HFn内部具有空腔结构, 利用该空腔作为微型反应器可以原位生成IONPs, 得到外直径为12~16 nm的核/壳结构(M-HFn纳米颗粒). 和天然铁蛋白及去铁铁蛋白相比, M-HFn纳米颗粒表现出增强的过氧化物酶活性. M-HFn纳米颗粒的肿瘤靶向性以及过氧化物酶样活性使其能够用于肿瘤组织切片染色[40]: 研究结果表明, 227例正常组织样本中只有11例有轻微染色,而274例肿瘤样本(包括肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胸腺癌、食管癌)全部显示深度染色, 且肿瘤细胞与周边正常细胞的分界区能够清晰辨别. 与异硫氰酸荧光素(FITC)标记HFn荧光染色和基于TfR1抗体的传统免疫组化染色相比,M-HFn纳米颗粒染色方法具有诸多优点: (1) 不受荧光漂白和自发荧光的干扰; (2) 与苏木精/伊红染色兼容, 可以提供更详细的组织病理学信息; (3) 精确性、灵敏度以及特异性高, 能够清晰区分肿瘤组织与周边正常组织; (4) 操作简单, 耗时短且重复性高; (5)M-HFn纳米颗粒制备简单, 成本低. 因此M-HFn纳米颗粒染色方法在快速及低成本诊断细胞癌变方面具有极大潜力.
2.2 IONPs体内分布检测
定量分析IONPs体内分布及代谢有助于了解其体内行为, 加速IONPs作为诊断、治疗以及诊疗一体化试剂在生物医学领域的应用, 因此简便、灵敏、特异及准确的IONPs含量分析方法非常重要. 普鲁士蓝染色法是检测组织器官内IONPs含量的常用方法, 但是该方法存在2个缺陷: (1) 灵敏度不高, 难以检测微量IONPs的存在; (2) 内源性含铁蛋白以及Fe3+会对检测结果造成干扰. 在IONPs表面交联成像物质(如放射性元素), 能够用于IONPs体内示踪, 但是这些成像物质可能会干扰IONPs体内分布和代谢, 并且这些物质还可能会从IONPs表面脱离, 造成错误检测结果. Zhuang等人[20]利用IONPs催化H2O2氧化DAB在IONPs原位生成不溶性棕色沉积物的特点, 开发了检测IONPs在组织器官内分布的方法(图1). 血清、乙醇、甲醇、二甲苯等组织样本处理常用试剂都不会影响IONPs酶样活性. 当组织器官内IONPs含量过低以至于无法被普鲁士蓝染色法检出时, IONPs染色法仍然有效. 因此IONPs染色法能够有效检测组织器官中IONPs含量. 该方法还可以扩展用于其他具有过氧化物酶活性的纳米颗粒的体内分布研究.
2.3 H2O2含量变化介导的物质测定
H2O2在生命活动(如信号传递、组织细胞损伤、底物氧化), 环境变化(如酸雨), 食品加工, 医疗卫生等领域都发挥着重要作用, 开发低成本、高特异性、操作简单、高稳定性的测定方法意义重大. IONPs的过氧化物酶样活性依赖于H2O2浓度, 因此催化反应可以用于H2O2含量测定[8,29,41~44]. Wei等人[8]以ABTS为显色底物, 对H2O2的检测限为3 μmol/L, 线性范围为5~100 μmol/L; Zhuang等人[41]以TMB为显色底物,对H2O2的检测限为0.175 μmol/L, 线性范围为0~70μmol/L; 利用IONPs催化H2O2生成的羟自由基会氧化CdTe量子点从而造成量子点荧光淬灭的特点, 以CdTe量子点荧光强度作为检测指标, Gao等人[43]将H2O2检 测 限 降 低 至 0.018 μmol/L, 线 性 范 围 为0.18~900 μmol/L.IONPs过氧化物酶样活性除了直接分析H2O2含量外, 还能够外延用于检测其他影响H2O2含量的物质: (1) 消耗H2O2的物质, 如三聚氰胺、GSH、对硝基苯酚等; (2) 间接转变为H2O2的物质, 如葡萄糖、半乳糖、胆固醇、胆碱等.
2.3.1 消耗H2O2的物质检测由于氮含量高, 三聚氰胺被非法用于奶制品加工, 虚假提高奶制品中蛋白质含量. 婴幼儿无法正常代谢三聚氰胺, 容易生成肾结石, 引起肾衰甚至死亡发生. 严格限制奶制品中非法添加三聚氰胺, 防止毒奶粉再次危害国民健康, 开发简便、快速、经济、高灵敏性的三聚氰胺检测技术刻不容缓. 利用三聚氰胺与H2O2反应生成一种对热高稳定性的加合物, 导致溶液中 H2O2含量降低的特点 , Ding等人[11]将IONPs-ABTS-H2O2体系用于原料奶以及奶粉中三聚氰胺含量鉴定, 检测限为2 μmol/L, 低于美国食品与药品管理局(FDA)以及中国规定的三聚氰胺安全限制(美国20 μmol/L, 中国8 μmol/L).GSH具有维持细胞内抗氧化环境, 抵御氧化损伤, 调节细胞信号转导等功能. GSH含量下降常常预示细胞内发生了严重氧化损伤, 并与多种疾病如癌症、肝损伤等相关. Ma等人[17]利用GSH会与H2O2反应从而降低溶液中H2O2含量的特点, 将IONPs-ABTS-H2O2体系用于生物样品中GSH含量鉴定, 检测限为3μmol/L, 线性范围为3~30 μmol/L.对硝基苯酚是一种毒性污染物, 具有潜在致癌性, 能够与H2O2反应从而消耗检测体系中的H2O2含量. Shi等人[45]利用IONPs-ABTS-H2O2体系对对硝基苯酚进行检测, 检测限为0.05 μmol/L, 线性范围为0.1~30 μmol/L.
2.3.2 生成H2O2的物质检测氧化酶可以催化溶解氧氧化相应底物并生成H2O2,测定H2O2浓度可以反推氧化底物的浓度. 因此偶联氧化酶和IONPs可以用于葡萄糖[8,22~24,28,31,43,45~49]、半乳糖[48]、乙醇[19]、胆固醇[47]、胆碱[13,48]及乙酰胆碱[50]等含量分析.结合葡萄糖氧化酶(GOx)催化葡萄糖氧化并生成H2O2的特点, Wei等[8]采用GOx-IONPs- ABTS体系建立了葡萄糖检测平台, 检测限为30 μmol/L, 线性范围为50~1000 μmol/L. Yu等人[22]发现表面修饰能增 强 IONPs 催 化 效 率 , 甘 氨 酸 修 饰 IONPs 能 将GOx-IONPs-ABTS体系测定葡萄糖的检测限降低至8.5 μmol/L. Liu等人[23]在IONPs表面同时修饰氨基与巯基, GOx-IONPs-ABTS体系测定葡萄糖的检测限更低至0.5 μmol/L. IONPs结合其他过氧化物模拟酶, 可以扩展底物接触面积以及提高电子传递效率, 协同增强催化活性: 卟啉-IONPs复合纳米材料[24], 介孔碳-IONPs复合纳米材料[28]
以及氧化石墨烯-IONPs复合纳米材料[31], 测定葡萄糖的检测限分别为2.21, 2和0.74 μmol/L.
Kim 等人[47]在介孔二氧化硅孔道内原位生成IONPs并共价交联GOx, 该偶联酶检测体系的初始催化活性比游离酶检测体系高3.5倍, 且热稳定性增加,对葡萄糖的检测限为3 μmol/L; 共价交联胆固醇氧化酶可以对胆固醇进行检测, 检测限为5 μmol/L. Liu等人[59]将GOx与酪蛋白修饰的IONPs混合制备纳米复合材料, 对葡萄糖的检测限为1 μmol/L. 荧光检测灵敏度高于比色法, 以苯甲酸为荧光底物, IONPs偶联GOx体系测定葡萄糖的检测限低至25 nmol/L[45]. Liu和Tseng[48]用amplex ultrared替代ABTS或者TMB,GOx-IONPs体系测定葡萄糖的检测限为3 μmol/L, 半乳糖氧化酶-IONPs以及胆碱氧化酶-IONPs体系对半乳糖和胆碱的检测限分别为2和20 μmol/L. Gao等人[43]利用IONPs催化H2O2生成的羟自由基会淬灭CdTe 量子点荧光的特点 , 对葡萄糖的检测限为 1μmol/L. He等人[49]在IONPs表面原位生成金纳米颗粒, 并对复合体包裹介孔二氧化硅壳层, 结合金纳米颗粒的GOx样活性, 构建了酶促级联放大反应体系.
金纳米颗粒催化葡萄糖氧化并生成H2O2, 二氧化硅壳层的存在限制了H2O2的扩散, 提高了局部底物浓度, 对葡萄糖的检测限为0.5 μmol/L. 类似于葡萄糖检测原理, 将IONPs和乙醇氧化酶共同组装在介孔二氧化硅内部能够用于乙醇含量测定(检测限: 25μmol/L; 线性范围: 100~500 μmol/L).利用戊二醛将壳聚糖修饰的IONPs和胆碱氧化酶共同交联在半胱胺修饰的金电极上, 该体系的稳定性以及对胆碱的特异性和灵敏度非常高(检测限0.1 nmol/L), 且具有很宽的线性范围(1×10-3~1×104μmol/L)[13]. 乙酰胆碱酯酶能够催化乙酰胆碱生成胆碱, 偶联IONPs-胆碱氧化酶体系可以用于乙酰胆碱的检测. IONPs-还原性氧化石墨烯纳米复合材料增强了IONPs的稳定性, 结合乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶用 于 乙 酰 胆 碱 检 测 , 具 有 较 低 的 检 测 限 (0.039μmol/L)和较宽的线性范围(0.1~1×104μmol/L)[50].
有机磷神经毒素与乙酰胆碱酯酶孵育会抑制乙酰胆碱酯酶活性, 导致乙酰胆碱酯酶/胆碱氧化酶催化乙酰胆碱生成H2O2含量下降, 进而降低IONPs催化活性, 利用该原理可以检测痕量有机磷神经毒素(图2),甲基对氧磷和沙林的检测限分别为10和1 nmol/L[60].
2.4 IONPs酶样活性抑制剂或者保护剂测定
除了表面修饰能够调节IONPs催化活性外, 某些物质能够吸附到IONPs表面, 阻碍IONPs与底物的接触, 抑制催化活性; 部分物质可以保护IONPs催化活性不受抑制剂影响. 通过测定IONPs催化活性的变化, 可以推算出待测物质的含量.
蛋白质分子的氨基酸组成差异使其等电点(pI)存在差异, 因此在反应溶液中所带电荷不同, 导致与IONPs的静电相互作用力也不同. 如在乙酸钠缓冲液中(pH 5.0), 脂肪酶(pI 5.6)会大量吸附在正电性IONPs表面形成蛋白质-纳米颗粒团聚体, 基本屏蔽了IONPs催化中心; 而溶菌酶(pI 11.0)只有极少量吸附在IONPs表面, 基本不影响IONPs催化效率. 总体而言, 蛋白质pI值高低与IONPs催化效率的抑制程度成反向关系. 除pI值外, 蛋白质大小和表面疏水性以及IONPs表面修饰也会影响蛋白质与IONPs相互作用, 进而影响IONPs催化活性. 因此利用蛋白质分子和IONPs的相互作用引起的催化活性变化能够敏感、快速、高效的鉴定不同蛋白质[15](图3).儿茶酚胺类物质(如多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、左旋多巴胺)参与多种大脑活动功能, 其含量异常与帕金森氏症、脑部创伤等密切相关. 电化学检测、高效液相色谱(HPLC)和毛细管/微芯片电泳等方法能够检测儿茶酚胺含量, 但是存在干扰因素多、成本高、耗时长等缺陷. Fe3+与儿茶酚基团的配位作用会促进儿茶酚胺吸附在IONPs表面, 降低IONPs催化效率, 因此IONPs能够用于病理样品中儿茶酚胺类物质含量检测. 恶性黑色素瘤细胞内酪氨酸酶含量增加, 酪氨酸酶能够催化酪氨酸生成左旋多巴胺, 因此IONPs能够延伸用于检测恶性黑色素瘤的发生及恶性进展情况[16].
