四氧化三铁纳米颗粒(IONPs)具有独特的超顺磁特性, 被广泛应用在污水处理、分析检测、生物大分子及细胞分离、药物靶向运输及可控释放、肿瘤磁热治疗、磁共振成像等领域[1~5]. 2007年中国科学院生物物理研究所阎锡蕴教授课题组[6]发现IONPs能够模拟辣根过氧化物酶(HRP)活性, 催化过氧化氢(H2O2)氧化底物(3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、邻苯二胺(OPD))产生颜色变化. 其催化活性与HRP类似, 依赖于H2O2浓度、pH和反应温度, 催化过程符合米氏动力学以及乒乓反应机制, 因此能够替代HRP应用在酶联免疫吸附分析(ELISA). 随后, 针对IONPs催化活性的研究如雨后春笋般涌现, 涵盖了包括环境保护、食品安全、生物医学等多个领域[7~21].
1 特征及优化
表面未经修饰的IONPs催化TMB-H2O2反应具有以下特征: 最适反应条件为pH 3.5, 40℃; 低浓度H2O2促进酶样活性, 高浓度H2O2抑制酶样活性; 催化过程符合米氏动力学以及乒乓反应机制; IONPs催化活性源于纳米颗粒表面的Fe2+; 颗粒越小, 比表面积越大, 单位质量纳米颗粒催化活性位点越多, 催化活性更高; 表面修饰基团的包被厚度会影响IONPs与底物的相互作用[6].IONPs在较宽pH(1~12)或者温度(4~90℃)的环境中孵育2 h后仍然保持良好的催化活性, 而HRP在pH低于5或者温度高于40℃的环境中孵育2 h后完全丧失了催化活性[6]. 叠氮钠是生物样品防腐抑菌的重要添加剂. 0.02%叠氮钠的存在抑制了HRP 99%催化活性, 而IONPs在该环境下能够保持93%催化活性. 即使叠氮钠浓度增加4倍, IONPs催化活性仍能维持在54%~82%水平[22]. IONPs催化活性对环境的强耐受性有望拓展其在分析领域特别是HRP使用受限环境中的应用.
过氧化物酶催化反应遵循米氏动力学, 米氏常数Km值大小表征酶与底物之间亲和力的大小, Km值高则酶对底物的亲和力低. IONPs具有类似HRP的催化功能, 但是其对底物H2O2的Km值却远高于HRP,表明其对H2O2的亲和力较低[6], 催化反应需要较高浓度的H2O2. 提高IONPs对H2O2及其他底物的亲和力, 可以增强IONPs的催化活性, 促进其过氧化物酶样活性的应用. 通过对IONPs纳米颗粒表面进行修饰, 改变表面电荷类型及大小, 有望增强IONPs与底物之间的静电相互作用, 进而增强IONPs的催化活性.
喻发全等人[22]考察了表面电荷以及表面包被厚度等因素对IONPs酶样活性的影响. 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)含有2个磺酸基,而TMB含有2个氨基. 由于静电相互作用, 纳米颗粒表面电荷会影响对这2种底物的亲和力, 进而影响催化效率. 肝素修饰的IONPs表面负电荷最强, 催化TMB效率也最高; 聚乙烯亚胺修饰的IONPs表面正电荷最强, 催化ABTS效率也最高. 刘艳萍和喻发全[23]发现氨基修饰增强了IONPs对ABTS的亲和力,而巯基修饰增强了IONPs对H2O2的亲和力. 在IONPs表面共同修饰氨基与巯基, 将同时增强IONPs对ABTS和H2O2的亲和力, 提高IONPs的催化活性, 有利于分析测定极微量H2O2以及其他能够转换为H2O2的物质. 卟啉能够加速电子在IONPs和底物之间传递而促进底物氧化, 故卟啉功能化能够增强IONPs过氧化物酶样活性[24].
不同形状的IONPs具有不同的比表面积和裸露晶面, 导致表面催化活性铁原子的数量不同, 因而会导致不同的催化活性. Nath等人[25]制备了右旋糖酐修饰的IONPs, 其对底物TMB的亲和力比未经修饰的IONPs强300倍. Liu等人[26]考察了不同形状IONPs的过氧化物酶样活性, 发现催化活性强弱顺序依次为团簇>三角片>八面体.除IONPs外, 大量纳米材料也具有过氧化物酶样活性, 将这些材料与IONPs组合制备复合材料, 可能会起到协同增强模拟酶活性的作用[27~31].
2 应用
IONPs过氧化物酶样活性催化机理可能是: H2O2以及底物 (如 TMB, ABTS等 )吸附在 IONPs表面 ;IONPs 表面的 Fe2+/Fe3+催化H2O2分解为羟自由基;IONPs通过部分电子交换作用稳定羟自由基; 羟自由基氧化底物发生颜色变化, 生成荧光产物, 或者化学发光等[12,24,32,33]. 充分利用催化机理及反应条件的可调节性, IONPs在环境保护、食品安全、生物研究、临床 诊 断 治 疗 等 领 域 具 有 广 泛 应 用 , 如 免 疫 测定[6,10,27,34~40]、分析物浓度检测[8,11,13~19,21~24,28,29,31,41~50]、清除污染物[7,9,12,30,32,33,51~56]、抑制细菌[57,58]以及肿瘤治疗[57]等.
2.1 免疫检测中作为HRP的替代物
HRP能够催化显色反应, 表面的赖氨酸残基可以与多种分子进行交联, 因此被广泛应用于免疫化学领域如蛋白质免疫印迹(western blot)、ELISA、免疫组化(IHC)等. 然而HRP的应用存在一定限制, 如长期储存容易失活, HRP-分子交联物的生产和纯化费用较高等. IONPs具有过氧化物酶活性, 且和天然HRP相比具有以下优点: 生产方法简便, 成本低廉,对恶劣环境抵抗力强易于保存, 具有磁性, 容易回收重复使用以及单分子催化活性更高等. 因此, IONPs可以作为HRP的替代物应用在免疫化学领域, 有望降低分析成本, 提高分析系统稳定性.
