3 结果
3. 1 方法的建立及优化 本研究建立的 3 个反应体系分别检测 CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 和 CYP2C19* 17 位点。最终确定 CYP2C19* 2、CYP2C19* 3 和CYP2C19* 17 反应液中野生型 / 突变型探针的浓度分别为 0. 1/0. 2 μmol·L- 1、0. 2/0. 3 μmol·L- 1,0. 3/0. 3 μmol·L- 1.GAPDH 内标系统探针浓度为 0. 05μmol·L- 1.荧光定量 PCR 反应体系： CYP2C19 反应液（ 包括5x PCR 缓冲液、dNTPs、特异性引物和探针、内标引物和探针、Taq 酶） 23 μL,DNA 模板 2 μL.为增加体系的特异性，将 PCR 退火温度从 60 ℃升高到62 ℃ .PCR 反应程序为： 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s,62 ℃60 s（ 收集荧光） ,40 个循环。
3. 2 方法的准确性评价 各用 2 例 15 ng·μL- 1相应的纯合突变型和杂合突变型样本，每个样本作为模板 分 别 加 入 CYP2C19 * 2、CYP2C19 * 3 和CYP2C19* 17 反应液进行检测。结果显示 3 种反应液检测纯合突变样本时，FAM 通道检测结果均为阴性（ Ct 值 > 36 或无 Ct 值） ,VIC 通道检测结果均为阳性（ Ct 值≤36） ; 检测杂合突变型样本时，FAM通道（ 野生型） 和 VIC 通道（ 突变型） 检测结果均为阳性（ Ct 值≤36） ; 所有样本的 ROX 通道（ 内标基因） 有明显扩增曲线（ Ct 值≤32） .结果表明建立的方法具有很好的准确性，结果见图 1.
3. 3 方法的灵敏度评价 各用 2 例 0. 5 ng·μL- 1的杂合突变型样本对 3 个反应体系的灵敏度进行检测。结果显示 3 种反应液检测杂合突变型样本的FAM 通道（ 野生型） 和 VIC 通道（ 突变型） 结果均为阳性（ Ct 值≤36） ,ROX 通道（ 内标基因） 有明显扩增曲线（ Ct 值≤32） .表明建立的方法可以检测低至浓度为每个反应体系约 1 ng 的人类全血 gDNA.结果见图 2.
3. 4 方法的特异性评价 用 2 例 15 ng·μL- 1的野生型样本（ CYP2C19* 1/* 1） 对 3 个反应体系的特异性进行评价。结果显示 3 个反应体系 FAM 通道检测结果均为阳性（ Ct 值≤36） ,而 VIC 通道均为阴性（ Ct 值 >36 或无 Ct 值） ,表明建立的方法具有很好的特异性，能够满足要求。结果见图 3.
3. 5 方法的临床适用性评价 用 100 例临床样本验证方法的临床适用性。临床样本的 CYP2C19 基因型检测结果如下： 36 例为 CYP2C19* 1 /* 2 杂合突变型（ 36 /100） ; 9 例为 CYP2C19* 2 /* 2 纯合突变型（ 9 /100） ; 6 例为 CYP2C19* 1 /* 3 杂合突变型（ 6 /100） ,1 例为 CYP2C19* 3 /* 3 纯合突变型（ 1 /100） ; 2 例为 CYP2C19* 2 /* 3 杂合突变型（ 2 /100） ; 2 例为 CYP2C19* 1 /* 17 杂合突变型（ 2 /100） ,1 例为 CYP2C19* 17 /* 17 纯合突变型（ 1 /100） ,其余为野生型。样本的测序结果与新建方法的 结 果 完 全 一 致 （ Kappa = 1. 00） ,结 果 见表 1.
4 讨论
CYP2C19 是 1993 年 Wrighton 首先从人类肝脏分离的一种酶[10],是 CYP450 酶系的重要成员，参与了许多药物的代谢，主要包括抗惊厥药（ 如苯妥英钠） 、质子泵抑制剂（ 如奥美拉唑） 、抗焦虑药（ 如安定） 、抗 抑 郁 药 及 抗 疟 疾 药 （ 如 白 乐 君） 等。
CYP2C19 存在着遗传多态性，可将人群分为快代谢型和慢代谢型。快代谢型人群，携带 CYP2C19 等位基因* 17 的杂合子和纯合子* 17/* 17,代谢药物比较快； 而慢代谢型人群，携带功能缺失型等位基因，可表现为纯合子 CYP2C19* 2/* 2 或* 3/* 3（ 后者较为少见） ,也可能表现为杂合子 CYP* 2/*3,代谢药物缓慢，容易导致药物的不良反应的产生。因此临床治疗时，对于快代谢型患者应适当加大药量以达到有效血药浓度，而慢代谢型患者应当减小药量以防止药物的不良反应。
氯吡格雷系新型的二磷酸腺苷受体拮抗剂，是一种新型的抗血小板药物，临床上用于心肌梗死、卒中、外周动脉疾病二级预防用药，成为冠心病患者经皮冠脉介入手术（ percutaneous coronary intervention,PCI） 及急性冠脉综合征患者的主要治疗药物之一。
氯吡格雷作为一种前体药物，本身没有活性，需要经CYP450 酶转化为活性代谢物，抑制血小板的活化和聚集。有研究报道 CYP2C19 等位基因突变纯合子* 2/* 2 型人群服用氯吡格雷时，不能将其转化为活性产物，导致支架内血栓的形成[11].目前大多数研究认为 CYP2C19 基因多态性与氯吡格雷抵抗存在关联性，其中以 CYP2C19* 2 关系最大。2010年美国 FDA 要求在氯吡格雷药物标签上注明CYP2C19 与疗效的关系，并建议使用前须检测CYP2C19 基因的多态性。临床上对接受氯吡格雷治疗的患者检测 CYP2C19 基因型，制定个体化治疗方案，指导临床合理化用药，解决氯吡格雷抵抗或低反应的问题，有助于减少 PCI 术后支架内血栓的形成和主要不良心血管事件的发生。
美国 FDA 批准了罗氏公司的 AmpliChip CYP450 Test 芯片，检测 CYP450 酶系的 CYP2D6 基因和CYP2C19 基因（ * 1、* 2 和* 3） 的突变，通过鉴定患者基因型和表型分类来预测其代谢的水平[12].美国 FDA 也 批 准 了 INFINITI CYP2C19 Assay（ CYP2C19 基因* 2、* 3 和* 17） 、Verigene CYP2C19 Nucleic Acid Test （ CYP2C19 基因 * 2、* 3 和 *17） 和 Spartan RX CYP2C19 Test System （ CYP2C19基因* 2、* 3 和* 17） ,检测 CYP2C19 基因的突变情况。国家食品药品监督管理总局批准了国内 2 个试剂盒： CYP2C19 基因检测试剂盒（ DNA 微阵列芯片法） 和人 CYP2C19 基因分型检测试剂盒（ 荧光PCR 法） .本研究建立的 CYP2C19 基因多态性检测方法（ 荧光 PCR 法） 与上述 2 种国内商业试剂盒相比，增加了 CYP2C19* 17 位点的检测，使 CYP2C19基因分型检测更为全面； 而且具有更高的灵敏度，能检测低至 1 ng/反应体系的样本。与 CYP2C19 基因检测试剂盒（ DNA 微阵列芯片法） 相比，本方法操作更为简单、快捷，整个检测过程可在 2 h 内完成，且具有更高的灵敏度。与人 CYP2C19 基因分型检测试剂盒（ 荧光 PCR 法） 相比，除增加 CYP2C19* 17位点的检测之外，本研究采用 FAM 和 VIC 双通道探针实现在 1 个反应管中检测 1 个位点的突变情况，而该商业试剂盒是将 1 个位点的野生/突变情况分开至 2 个反应管中进行，本研究简化了反应体系和实验操作，也使结果判读更为方便、直观。
综上所述，本研究建立了一种能准确、特异、灵敏、简便和快速检测 CYP2C19 基因多态性的荧光PCR 法。通过检测 CYP2C19 基因多态性，可以评估个体对受 CYP2C19 酶基因多态性影响的药物疗效，对指导临床合理用药，实现个体化治疗具有重要的临床价值和实践意义。
参考文献
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