4. 2 光学检测
光学法是用于心肌标志物的主要检测方式之一，也是目前微流控芯片研究中应用最广泛的检测方式。根据检测原理的不同，光学检测可分为荧光检测法、紫外-可见吸收光谱检测法、化学发光和生物发光检测法、表面增强拉曼散射检测法、光纤检测法及表面等离子体共振检测法等。
4. 2. 1 荧光（ Fluorescence） 法 对于心肌标志物的检测，生物学家通常利用荧光物质标记抗原或抗体或酶标抗体，然后从反应生成物的荧光强度、反应底物比色和捕获化学发光底物微光来定量被检测物的浓度。由于微流控芯片微米级尺度的检测通道，荧光免疫方法有时难以满足对低浓度心肌标志物的检测要求。为了提高微流控光学检测的灵敏度，目前研究主要通过对样品预先处理或者预浓缩方式来实现。利用微流控芯片微米级的检测通道，Shin 等[17]创新性地设计了可浓缩荧光标记物的反应池和嵌入式光电倍增管检测装置，用于实现对超敏 C 反应蛋白 （ CRP） 的低浓度检测 （ ~ 1. 4 nmol/L） .
Christodoulides 等[19]将共价键合抗体的琼脂凝胶微珠引入微流控芯片中，结合微球免疫分析，增大抗原抗体的结合面积，检出限达 5 fg/mL,检测灵敏度优于商品化超敏 CRP ELISA 检测试剂盒。Jnsson等[15]则对芯片表面进行环烯共聚物改性，分别用氧等离子体氧化、APTES 硅烷化和右旋糖酐修饰，增加其表面亲水性，结合免疫检测方法，实现血液中 CRP 的低浓度检测，检出限达 2. 6 ng/mL.
不同的心肌标志物通常需要进行多种荧光标记，利用微流控芯片高通量分析特点，可以实现多种心肌标记物的同时检测。这种方式将进一步节省试剂成本、缩短反应时间，是未来实现快速生化检验的主要趋势。Caulim 等[28]根据荧光标记在芯片胶束电动色谱中有不同的迁移率，对 CK-MB,cTnT,cTnI 和Myo 4 种心肌标志物进行了定量分析。Stringer 等[29]结合荧光共振能量转移和液芯波导技术，实现了cTnI 的高灵敏度快速检测。但这些方法的检测装置较复杂，能实现微流控芯片的高通量分析，但不利于开发适合即时诊断的产品。Cho 等[30]设计了一种由免疫层析试纸条和微型荧光检测装置组成的微流控免疫纸芯片检测装置，同时分析 AMI 的 3 种心肌标志物 CK-MB、cTnI 和 Myo.他们首先以同一荧光染料 Alexa Fluor 647 对以上 3 种心肌标志物抗体进行标记，使反应后抗原-荧光抗体复合物在硝酸纤维素膜中层析分离，进而被不同的心肌标志物二抗捕获，通过定量不同荧光标签量来定量各组分标志物浓度。为了避免荧光背景色干扰，作者在微流控免疫纸芯片检测装置中引入两向驱动设计，分别驱动样品的层析分离和荧光背景色的洗脱。利用该平台对 CK-MB,cTnI 和 Myo 的检出限分别为0. 2 ng/mL,0. 05 pg / mL 和 2 ng / mL（ 图 2） .这种基于微流控免疫芯片的多种心肌标志物联合检测方式有利于 AMI的早期诊断，特别是在家庭医疗中具有潜在应用价值。
4. 2. 2 化学发光（ Chemiluminescence） 化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。与传统荧光检测方法相比，由于化学发光无需外来光源，降低了对设备的要求，易于微型化和集成化，符合微流控芯片的发展趋势。微流控化学发光免疫分析将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，通过检测发光强度来确定痕量心肌标志物的含量。Yang 等[31]设计制备了一种包含有液体通道层、气动层和预留空气层的三层 PDMS 芯片，芯片上整合有微泵、微阀和微混合器。基于化学发光原理测定血样中 CRP 时，最低检出限为 0. 0125 mg/mL,检测时间为 25 min,与医院现有方法相比，检测灵敏度和时间都得到很大改善。Bhattacharyya 等[32]通过热压法制作含八通道的塑料微流控芯片，利用辣根过氧化物酶标记二抗，鲁米诺为化学发光底物，在同一块芯片同时进行标准曲线和 CRP 样本的检测，检测时间仅为 25 min.Cho 等[33]在多层纸基芯片上进行酶联免疫分析（ ELISA） 用以检测 cTnI,检出限达 0. 027 ng/mL.该方法通过改变样本引入方向，实现抗原抗体垂直侧向流扩散，酶底物水平侧向流扩散，节省了反应时间。
4. 2. 3 表面等离子体共振（ Surface plasmon resonance,SPR） 表面等离子体共振（ SPR） 检测是通过监测生物反应过程中 SPR 的动态变化，获取生物分子相互作用的特异信号。该方法具有无需标记、可实时快速检测等特点，非常适合与微流控芯片结合，进行生物样本的分析检测。目前，基于 SPR 的微流控免疫芯片已经尝试用于多种癌症标记蛋白、病毒抗体蛋白、药物性抗体、药物蛋白以及分子生物标记物的检测[34].ELISA 是医院常规用于人体炎症蛋白 CRP 的主要检测方法，但其容易受到基质及组成颜色的影响。Meyer 等[35]研究建立了一种基于 SPR 免疫传感器的 CRP 检测方法，采用生物素-链霉亲和素的夹心法装置，对于样品颜色、来源及基质无限制。在 Dutra 等[36]的研究中，cTnT 的单克隆抗体用生物素标记后通过半胱氨酸偶联固定到硫脲自组装单层膜上，SPR 传感器检测在 0. 05 ~4. 5 ng/mL范围内显示出良好的线性相关性和重复性。
在 SPR 分析过程中，一般将抗原或抗体键合在晶片表面的葡萄糖上，在检测过程中，除抗体与抗原专一性结合外，还有部分蛋白质会吸附在葡萄糖上，造成非特异性信号过高。为降低非特异性结合的信号，Masson 等[16,37]利用含 N-羟基琥珀酰亚胺的 16-巯基十六烷酸固化抗体，在含有血清的液体中，对Myo 和 cTnI 进行检测，实验结果显着抑制非特异性结合的信号，Myo 和 cTnI 的检出限达到 1 ng / mL.
Kurita 等[23]则设计通道 T 型管道结构用以防止待测溶液流过金膜表面，降低非特异性结合的信号。作者通过在通道固定 B 型促尿钠排泄肽（ BNP） 抗原，捕获免疫反应后混合物中过量的游离酶标抗体，而酶标抗体-抗原复合物则直接流过。被捕获的酶标抗体上的酶催化流经的底物反应，生成的带巯基的产物共价结合于通道内的金膜表面，利用表面等离子体共振技术检测，如图 3 所示，分析时间为 30 min ,检测范围为 0. 005 ~100 ng/mL,覆盖了血液样品中 BNP 的浓度范围。这种 T 型结构的芯片设计能够实现同时对酶催化反应和产物积聚的实时监测，可满足对实际生物样品（ 如人血清） 的检测。
4. 2. 4 表面增强拉曼散射（ Surface-enhanced raman scattering,SERS） 表面拉曼散射主要利用系统中分子振动、转动及低频振荡所提供的“化学指纹”鉴定特定的分析物。该方法具有极高检测灵敏度和选择性，对蛋白质、核酸或其它生物色素的测定低达 ng 至 pg 水平的痕量分析[38].目前，基于 SERS 的微流控免疫芯片用于心肌相关标志物检测的文献较少，仅有的几项报道研究已经显示出该项技术可用于医学检验的应用潜力。Bizzarri 等[39]以单个拉曼分子修饰的纳米银为 SERS 探针，设计了 SERS 检测平台，实现了 Myo 分子的极微量检测，检出限达10!11mol / L.Campbell 等[40]的工作则使用了 SERS 探针实现 CRP 的微量检测，检出限达到 0. 3 ng/mL,远超出医院常规规定的 μg/mL 级别的检测能力。
对不同的标志物进行不同的拉曼分子标记，实现多种心肌标志物的联合检测是 SERS 未来发展的趋势。Chon 等[18]设计了一种分支结构的微流控通道，可将分析物在多个通道内逐次稀释，此法可减少样品制备的时间，采用夹心型免疫分析法同时定量检测了 cTnI 和 CK-MB.他们首先将作为拉曼信号分子的孔雀石绿与 cTnI 抗原结合，拉曼信号分子罗丹明同分异构体（ Rhodamine isothiocyanate,XRITC） 与CK-MB 抗原结合并连接到中空的金纳米球表面； 其次，在磁珠表面连接上 cTnI 和 CK-MB 单克隆抗体，当两者分别与抗原结合时即形成夹心结构。收集通道内的磁珠，最后用缓冲液洗去未连接的抗原，磁珠和纳米球即可进行 SERS 检测。以孔雀石绿分子在 1616 cm!1处和 XRITC 在 1650 cm!1的相对拉曼强度进行计算，可发现当 cTnI 和 CK-MB 浓度在 10 pg/mL ~1 μg/mL 时，该峰强与浓度有良好的线性关系，cTnI 和 CK-MB 检出限分别为 33. 7 和 42. 5 pg / mL（ 图 3） .微流控技术与 SERS 相结合，可快速、高灵敏地同时检测血清中多个心肌标记物的信号，将进一步发挥其临床应用潜力。
5 总结与展望
微流控芯片是近几年发展起来的一种前沿分析技术，它具有分析时间短、样品耗量少、分析通量高和易于集成等特点，已经在心肌损伤标志物检测和与临床相关的多种生化指标监测等方面显示出很大优势，在心血管疾病早期预警和重要标志物的快速筛查等方面具有应用潜力。近年来，随着微纳制造工艺、新材料和多种信息检测等技术的快速发展，微流控芯片设计和集成装置性能将会获得进一步提升，主要表现在： （ 1） 提高集成微流控芯片的精确分析能力，融合精密制造和自动控制等多种新技术元素，发展具有可与医院大型检测设备相媲美的精确分析定量能力。（ 2） 将移动互联网与微流控芯片技术相结合，开发新型现场床边检测（ Point-of-care testing,POCT） 装置，并与可视化远程监测系统相融合。微流控芯片系统的微型化、集成化和自动化是实现快速生化检验和重大疾病标志物筛查的重要平台，也是发展低成本健康关键技术的主要途径，预期在未来个性化医疗、疾病早期预警以及社区健康医疗等方面发挥越来越重要的作用。（图表略）
References
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