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单基因病的最新基因诊断技术概述(3)

来源:学术堂 作者:原来是喵
发布于:2016-11-16 共13569字
  3.3.2 DHPLC技术
  
  DHPLC是 一种高通量筛选DNA序 列变异的技术,主要用来分析异质性双链结构:(1)在不变性的温度条件下,检测并分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段;(2)在完全变性温度条件下,可以区分单链DNA或RNA分子,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制;(3)在部分变性的温度条件下,变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程,不仅分别形成同源双链,同时也错配形成异源双链,根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离,从而识别变异型[37-38].
  
  该技术可进行基因突变检测、SNP分析等方面的研究;可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段;快速高效无毒经济;除了检测已知突变还能检测未知突变;自动化程度高;其敏感性和特异性可达90%以上,明显高于单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)检测技术。但该技术不能检测纯合突变,检测纯合突变需在PCR产物中加入野生型扩增产物;不能确定突变的具体位点,也不能确定是哪种突变类型;仪器价格高,分离柱有一定的使用寿命,需定时更换;目前仅用于检测200 bp~500 bp大小的DNA片段;引物二聚体、非特异扩增产物以及与样品碱基数类似的污染产物将会影响分析,需通过优化PCR去除之;PCR产物浓度必须足够大,否则会导致信噪比下降,分析结果的可靠性也会随之下降[37-38].
  
  3.3.3 HRM技术
  
  HRM主要用于未知突变筛查。根据目标DNA序列的长度、GC含量及碱基的互补性差异,利用HRM对样品的基因型进行分析,其分辨精度可达单个碱基的差异。由于每一段DNA都有其独特的序列,因而在加热变性时就会有独特的溶解曲线形状,它可以通过DNA分子缓慢升温过程中饱和荧光染料荧光值的变化而得到具体显现。如同DNA指纹图谱一样,具有很高的特异性、稳定性和可重复性。根据它们独特的溶解曲线,即突变片段与野生型片段熔解曲线的形状和位置存在差异,就可以对不同的核酸片段进行区分[39].
  
  该法在突变筛查中其便捷性、灵敏性与特异性均优于DHPLC,并且检测成本较低,耗时较少,是近年来发展起来的核酸分析技术。灵敏快速无毒高效,对已知和未知的突变都可检测。但和DHPLC一样,不能准确检测具体突变[39].
  
  3.3.4 MLPA技术
  
  针对基因内 每个待检区 域设计一对DNA探针。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,一段引物序列和一段特异性杂交序列。在MLPA反应中,2个寡 核苷酸片 段都与靶序 列进行杂交,之后使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列特异性序列完全互补,连接酶才能将2段探针连接成一条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有一个碱基的差别,连接反应也无法进行。连接反应完成后,用一对通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的,范围在130 bp~480 bp.最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,收集数据,软件分析,得出结论。只有当连接反应完成,才能进行随后PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰,如果检测的靶序列发生点突变或缺失、重复突变,那么相应探针扩增峰便会缺失、降低或增加,根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在[40-41].
  
  该法高效、特异,在一个PCR反应中可以同时扩增数十个探针的连接产物,可用40对~50对特异探针,一次性检测40种~50种突变类型,可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变,实现了高通量的缺失检测。同时该技术所具有的相对定量能力还能对基因的重复进行判断。近年来,MLPA在技术与应用上又有许多新的发展,如运用化学合成法制备3′、5′探针,在基因甲基化检测、基因表达水平分析、基因部分片段重复区域拷贝数分析及转基因基因分型中获得广泛应用,加上MLPA与基因芯片微阵列技术的结合,使得多重连接探针扩增真正具备了高通量检测能力[41].但该法需要毛细管电泳装置,试剂盒价格较高;只能检测已知突变。
  
  3.3.5蛋 白 截 短 测 试 法(protein truncation test,PTT)
  
  本方法是从蛋白质水平的变化来检测基因突变,它主要检测导致开放阅读框架改变的碱基缺失或插入突变等。检测时须提取细胞m RNA,将待测靶基因逆转录为c DNA,所用逆转录引物含一段T7启动子和真核细胞翻译起始序列,逆转录产物在无细胞提取液中翻译为相应的蛋白质。如果基因突变导致了开放阅读框架的改变,那么合成的蛋白质经SDS-PAGE分离时会出现比正常蛋白质或长或短的蛋白产物[42-43].
  
  本法突变检出率高,一次可处理大量的样品,并可检测4~5 kb片段的突变。但不能检测不影响开放阅读框架的突变,且需要抽提组织m RNA.另外,移码突变如果太靠近基因的5′端或3′端,用聚丙烯酰胺凝胶电泳也无法检测出,由差异剪切所形成的异构体也会影响结果的分析。
  
  3.4 DNA chip技术
  
  用于检测已知突变,是90年代后发展的一项DNA分析新技术。按应用的不同,基因芯片可分为:基因表达谱芯片和寡核苷酸芯片。按核酸探针的不同,可分为:寡核苷酸芯片和c DNA芯片。按介质的不同,可分为:玻璃片、硅片、尼龙膜、陶瓷和微型磁珠等。按用途的不同,可分为:表达谱芯片、诊断芯片、测序芯片、毒理芯片和指纹图谱芯片等。按点样方法的不同,可分为光刻基因芯片、机械微型点样基因芯片、液体喷射技术基因芯片等。按制备方法的不同,可分为:原位合成和直接点样[38].基因芯片技术集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术,可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面也有广阔的前景。DNA芯片技术将生物技术和信息技术有机结合,是今后基因诊断的发展方向和趋势[44-46].
  
  该技术检测信息高通量,自动化程度高,一次可检测众多突变位点,具有很大的发展潜力,将在基因突变检测中发挥非常重要的作用,可用于疾病临床早期诊断和批量筛选,确定疾病亚型和选择最佳治疗方案;也可用于耐药基因的筛选以及新药的研发。PCR核酸诊断技术虽经典,但难以满足现今检验、检疫需求,而“微流控芯片技术”既含盖微流体操作系统又满足实验结果的分析功能。由于芯片“实验室”排污很少,故被称作是一种“绿色”技术[45-46].芯片技术虽然优点众多,但成本高,技术含量高,目前普及推广还有一定难度。
  
  3.5 DNA序列分析技术
  
  DNA序 列分析是一种非常重要的基因诊断技术,被称为是基因诊断的金标准。近10年来发展非常迅速,从第一代Sanger法测序开始,经历第二代的高通量测序技术,至今已发展到第三代---单细胞测序技术。
  
  关于1代~3代测序技术的原理、优缺点、在基因诊断中的应用以及3代测序技术特点的比较,详见文献[6],本文不再赘述。
  
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