本文重点围绕基因诊断技术的最新进展进行综述，以期对临床诊断和预防工作提供一些有益的启示。大家在相关论文写作时，可以参考这篇题目为“单基因病的最新基因诊断技术概述”的医学技术论文。
原标题：单基因遗传病基因诊断技术研究进展
摘要：单基因遗传病（简称单基因病）种类、分型繁多，常规诊断难以确诊，而基因诊断技术在遗传病特别是单基因病的确诊、分型等方面都发挥着不可或缺的作用。近一、二十年来，基因诊断技术进展迅猛，各种检测方法层出不穷。本文重点围绕基因诊断技术的最新进展进行综述，以期对临床诊断和预防工作提供一些有益的启示。
关键词：单基因病；基因诊断；技术方法
在5大类遗传病[包括单基因遗传病（简称单基因病）、多基因病、染色体病、线粒体病和体细胞遗传病]中，病种最多的当属单基因病[1-3].据在线人类孟德尔遗传最新报道，已被美国国家生物技术信息中心正式收录的就有22 000多种[3].
对于基因病，基因诊断被公认是确诊该类疾病最准确、最可靠的诊断技术和金标准，它可以在分子水平甚至在单个碱基发生改变的情况下作出明确诊断。基因诊断是继形态学、生物化学和免疫诊断学之后的第四代诊断技术，是诊断学领域的一次革命[4].它打破常规诊断的方式，不以疾病的表型为主要依据，而是采用分子生物学的技术和方法，直接检测被检者某一特定基因的结构或者功能是否异常，从而对疾病作出诊断。相对于常规诊断，基因诊断更注重个体基因状态，不仅可以对患者所患疾病做出判断，还可以对表型正常的携带者或者遗传易感者做出前瞻性诊断[4-5].基因诊断具有高特异性、高灵敏性、早期诊断性和应用广泛性等特点，因此日益得到普及和推广。近一、二十年来，基因诊断技术取得了前所未有的进步。随着该技术在临床检测中的推广、应用，其已为早期诊断单基因病、多基因病以及肿瘤遗传病、线粒体遗传病等带来了曙光。回顾基因诊断的发展历程，不难看出，它经历了从间接诊断到直接诊断，从简单到复杂再回归简单，从单一技术到整合技术，从时间长、成本高、通量低、需手工操作到快速、廉价、高通量、自动化，从多细胞到单分子，从用量多到用量少的过程[6].下面重点对单基因病的最新基因诊断技术做一概述。
1基因诊断技术分类
基因诊断通常在基因定位、基因克隆、基因序列、蛋白结构已经弄清或虽未弄清但与其他遗传标记的连锁关系已经明确的情况下进行，大致分为间接诊断和直接诊断2大类。
从发展历程和诊断策略来看，基因诊断技术包括：（1）连锁分析类：限制性片段长度多态性（restric-tion fragment length polymorphism, RFLP）、可变数目串联重复（variable number of tandem repeat, VN-TR）、短串联重复（short tandem repeat, STR）、简单序列长度多态性（simple sequence length polymor-phism, SSLP）、扩增片段长度多态性（amplified frag-ment length polymorphism, Amp-FLP）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）；（2）分子杂交类：Southern印迹杂交（Southern blot）、斑点杂 交（dot blot）、反 向 点 杂 交（reverse dot blot,RDB）、Northern印 迹杂交（northern blot）、蛋白质印迹杂交（western blot）、抑制性消减杂交（suppressionsubtractive hybridization, SSH）；（3）PCR及 其衍生技术类：聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、不对称PCR （asymmetric PCR）、多重PCR（multiplex PCR）、多 重 巢 式PCR （multiplex-nestedPCR）、长片段PCR （long PCR）、三引物PCR（tri-primer PCR, TP-PCR）、逆 转 录PCR （reverse tran-scription PCR, RT-PCR）、实 时 荧 光 定 量PCR （realtime quantitative PCR, RTQ-PCR或q PCR）、数字PCR技 术（digital PCR, d PCR）、PCR寡 核苷酸探针杂交（sequence-specific oligonucleotide primed PCR,PCR-SSO）、扩增阻碍突变系统（amplification re-fractory mutation system, ARMS）[即等位基因特异性扩增（allele-specific amplification, ASA）]、高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting curve analy-sis, HRM）、多重连接探 针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification , MLPA）、变 性 高 效液 相 色 谱 分 析（denaturing high-performance liquidchromatograph, DHPLC）、 DNA生 物传感器检测法（DNA biosensors）； （4）基 因芯片（DNA chip）技 术：c DNA芯片、寡核苷酸芯片等；（5）基因序列分析类：Sanger法测序、高通量测序技术（high-throughput se-quencing）[即下一代测序技术（next-generation se-quencing, NGS）]、基因组扩增转录同步测序法（ge-nomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）、全外显子测序（whole-exome sequencing,WES）[即外显子组测序（exome sequencing）]、全基因 组 测 序（whole-genome sequencing, WGS）、第 三代测序技术等数十种。随着科学技术的飞速发展，基因诊断和各种组学的新技术新方法也在不断涌现并日益在临床医学中发挥着重要的作用。
2间接诊断
间接诊断是指当致病基因本身尚属未知或致病基因虽然已知但其突变尚属未知时，可以通过对患者及其家系成员进行连锁分析或单倍型分析，从而推断受检者是否带有致病基因的一种诊断方法。
连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常会一起传递给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，即可间接地判断致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位点，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为遗传标记。 RFLP、SSLP、STR、SNP等均可用于连锁分析。通过多位点的连锁分析，还可进行亲子鉴定等。通常，RFLP被认为是第一代遗传标记，SSLP / STR是第二代遗传标记，SNP是第三代遗传标记[7].
3直接诊断
对于基因序列、结构、功能、突变类型都 清楚的、且发生于候选基因内的突变的检测，可以采用直接诊断的方法。直接诊断是指直接检查目的基因本身有无异常。它通常是用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因有无突变、缺失等异常并阐明突变的性质和突变的类型等。直接诊断适用于已知基因异常的疾病。下面分别介绍。
3.1分子杂交及相关技术
互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即所谓的分子杂交。分子杂交技术包括South-ern blot、 northern blot、 dot blot、 RDB、 SSH、 DNAbiosensors、western blot等。其 中，Southern blot、northern blot和dot blot、RDB、SSH、DNA biosensors也 称 核 酸 的 分 子 杂 交，用 于 检 测 特 定 的DNA、RNA;western blot又称免疫学测定，用于检测特定的蛋白质。核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一，其中，SSH技术、DNA生物传感器检测法比较新颖，本节重点介绍它们。
3.1.1 SSH技术
SSH技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，是一种以抑制性PCR（利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增）反应为基础，将标准化测试c DNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。它是建立在抑制性杂交和选择性PCR基础上的差异表达基因筛选手段。通过合成2个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试c DNA片段的5′末端，将测试和驱动进行两轮杂交[8-9].
该技术具有筛选高效、假阳性率低的优点，因而广泛应用在动物、植物、人类及癌症等研究领域[5].在高血糖发病的研究中，研究者利用SSH方法发现丙酮酸羧激酶和胆固醇O-乙酰基转移酶2个基因与葡萄糖激酶代谢紧密相关，并利用RTQ-PCR对其进行了验证[10];在进行葡萄糖激酶对肾脏功 能 影 响 研 究 时 筛 选 到 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶3（glutathione peroxidase-3, GPX3）基 因 表达发生改变，并且GPX3可作为肾脏损伤初期的标记物[11].Ren等[12]利用SSH方法鉴定出旋毛虫肌肉期幼虫与肠道期幼虫的9个差异表达基因（Ts7、Ts8、Ts11、Ts17、Ts19、Ts22、Ts23、Ts26、Ts33），对旋毛虫肌肉期幼虫转变成肠道期幼虫的相关机理进行了阐述。曹振龙等[9]利用SSH方法对小鼠MOE内受AC3调控 的 差 异 表 达 基 因 进 行 了 筛 选，获 得 了kcnk3、mapk7、megf11、c-mip、skp1a、mlycd、tmem88b、trap-pc5、ppat、ssr3等 差异表达基因，并证实这些基因分别与K+通道、胞外信号调控、胞内蛋白泛素化因子、胞内蛋白转膜与运输等生物学功能相关。 SSH法所需实验材料是通过PCR扩增获得，整个过程包括多次酚：氯仿抽提，这些过程可能会使部分基因丢失，此为其不足之处。
3.1.2 DNA biosensors技术
该技术是由固定有已知的核苷酸序列的单链DNA（ss DNA）的 电极（探头）和换能器2部 分组成。固定在传感器电极上的ss DNA探针与待测样品的目标DNA杂交，形成双链DNA,杂交反应在传感器电极上直接完成，换能器将杂交过程中所产生的变化转换成电、光、声等物理信号，从而对待检样品进行检测[13].该技术灵敏度高，快速经济，无需标记；检测装置简单轻巧，易于实现微型化；检测过程中不受样品混浊度限制。适合研究碱基错配对DNA电子传递性质的影响[13].
3.2 PCR及其衍生技术
对于基因突变的检测，在1985以前主要是利用Southern印迹法，它可以检出基因的缺失、插入、重组等突变形式，而点突变、微缺失、微插入则很难检出，只能应用PCR结合其他方法完成。 PCR技术是突变研究中的重大进展，目前几乎所有的基因突变检测技 术都是建 立在PCR基 础 之 上，并 且 由PCR衍生出许多新方法，目前已达20余种，自动化程度也越来越高，分析时间也大大缩短，分析结果的准确性也有很大提高。这是因为PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的1.5 h~3 h内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素来提高其敏感性，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断现可以缩短至数小时甚至1 h~2 h.
PCR技 术目前有许多新的发展，用途日益扩大。本小节重点介绍TP-PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR这几种。
