表面特性包括表面微形貌、化学能、润湿性及自由能等，影响蛋白吸附水平从而影响细胞粘附。大量体外研究对不同细胞在材料表面的细胞行为学比较，均显示了根据表面性能不同所表现出不同的细胞学反应。本研究通过对细胞粘附过程各时间点细胞形态进行扫描电镜观察以及通过核荧光染色计算粘附率，比较评估不同氧化铝喷砂-酸蚀（ sandblast-ed alumina acid-etched,SAA） 亲水性纯钛表面细胞粘附反应。
1 材料和方法
1. 1 材料制备和分组
医用纯钛（ 陕西宝鸡有色金属工业公司） 经机械加工为直径 12 mm、厚 2 mm 的圆盘试件，由直径100 ~ 200 μm、200 ~ 300 μm 及 300 ~ 400 μm 的Al2O3颗粒喷砂、相同条件下恒温酸蚀处理分别得到SAA 表面的 3 个处理组： A 组、B 组和 C 组； 对照组为未处理的钛片打磨抛光得到光滑钛片。制备 4 组试样，每组 50 个，所有试样经丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗后，生理盐水储存，γ 射线（ 25. 0 kGy,12 h） （ 华大辐照中心提供） 消毒备用。各组随机抽取 6 个，表面形貌仪测量表面粗糙度（ Ra） .
1. 2 表面静态水接触角检测
采用光学接触角测量仪座滴法测定计算蒸馏水在钛片表面静态水接触角，并采用连续聚焦放大变焦透镜记录水滴在各处理组材料表面接触瞬间照片。
1. 3 细胞接种培养及扫描电镜观察
将消毒后的 4 组钛片置于 24 孔培养板内，将人成骨肉瘤细胞系 MG63 以 1 × 104个/cm2的浓度接种于处理钛片表面，培养 2 h、4 h、8 h 取出钛片。扫描电镜下观察各组各时间点的细胞形态。
1. 4 4 组钛片表面细胞核荧光染色及计数
将 MG63 接种于钛片表面，方法及密度同 1. 3,培养 2 h、4 h、8 h 后吸出培养液，冲洗，3. 7% 多聚甲醛固定，冲洗，加入 0. 1%Triton X-100 裂解，冲洗，加入 Hoechst33342（ Invitrogen,美国） （ 1∶ 10 000 稀释）避光染色 20 min 甘油封片。在荧光显微镜下摄片，使用图像软件分析计数。粘附率 = 粘附细胞量/接种细胞量 ×100%.
1. 5 统计学分析
以上每个时间段每组均为 6 个样本量，每个样本重复测量 3 次。采用 SPSS 13. 0 统计学软件分析数据，多个样本均数比较采用单因素方差分析，方差齐则采用 LSD 样本均数间的两两比较，方差不齐则采用 Welch 方法进行方差分析后，Dunnett's T3 多重比较，P <0. 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 表面粗糙度及表面静态水接触角结果
对照组、A 组、B 组和 C 组表面粗糙度（ Ra） 分别为（ 0. 27 ± 0. 11） μm、（ 1. 69 ± 0. 05） μm、（ 2. 08 ±0. 11） μm和（ 2. 55 ± 0. 20） μm,两两比较 Ra 值差异具有统计学意义（ P <0. 05） .表面静态水接触角的测量结果如表 1 所示，3 个处理组润湿性良好，对照组较差（ 图 1） .
方差分析比较 4 组间整体差异具有统计学意义（ F = 1 900. 164,P < 0. 001） ; 对照组分别与 A、B、C3 组差异具有统计学意义（ P < 0. 001） ,A、B、C 3 组两两比较差异无统计学意义（ P >0. 05） .
2. 2 扫描电镜观察 4 组钛片 MG63 粘附情况
4 组钛片接种 MG63 后 3 个时间段粘附、伸展的形貌如图 2 所示。4 组细胞在接种 2 h 时均发生粘附； 3 组处理组细胞多数呈球形，细胞直径约为10 μm,粘附于大孔洞内，对照组细胞在钛片上铺展开，5 000 倍扫描电镜下观察各组细胞2 h 粘附情况，可见处理组与对照组细胞粘附的位点之间存在差异（ 图 3） ,以及 3 个处理组之间大凹坑样结构与细胞的相对大小不同，并且细胞已经与材料表面接触同时发生了形态学变化。3 000 倍扫描电镜观察，可见4 h 时，对照组细胞沿沟纹方向伸展，并向周围细胞伸出突触； 3 个处理组细胞在大孔洞内向孔洞隆起的边嵴伸出突起，A 组和 B 组较 C 组先伸出指状突触（ 图 3） .8 h 时，各组细胞已经开始呈现明显的多角形、梭形。比较各组图像得出，细胞呈时间规律性地发生粘附和伸展。对照组细胞较早发生粘附和伸展，细胞呈平铺薄层状平行排列； 处理组细胞伸展相对于对照组更立体，胞浆丰富，表面伪足突起更多，细胞间连接更加广泛。处理组中，A 组、B 组伸展情况优于 C 组。
2. 3 钛片上细胞荧光显微镜下粘附率的比较
4 组钛片各时间段的粘附率见表 2,各组细胞粘附率都呈现了时间依赖性，随着时间的增加粘附率上升。经析因方差分析，处理组不同时间段间差异有统计学意义（ F =2 301. 489,P <0. 001） ; 不同处理组间差异有统计学意义（ F =95. 449,P <0. 001） ; 不同时间段与不同处理组两因素间有交互作用（ F =31. 131,P < 0. 001） .
2 h 时，对照组高于处理组，对照组与处理组差异均有统计学意义（ P < 0. 001） ,3 个处理组两两之间差异均无统计学意义。4 h 时，4 组间差异有统计学意义（ P <0. 05） ,对照组低于处理组（ P < 0. 05） ,3 个处理组两两之间差异均无统计学意义。8 h 时，4 组间差异有统计学意义（ P < 0. 05） ,对照组低于处理组（ P < 0. 05） ,对照组与处理组差异均有统计学意义（ P <0. 05） ,A 组和 B 组之间差异无统计学意义； C 组与 A 组和 B 组差异存在统计学意义（ P <0. 05） ,C 组低于 A 组和 B 组。
3 讨 论
Wennerberg 系统性回顾体内试验的研究得出，中度粗糙也就是粗糙度在 1 ~2 μm 的表面得到最佳的骨整合，而单一的粗糙度并不能作为种植体的评价标准[1].由 80 年代开始，随着生物材料的发展，研究越来越多的集中在表面化学能、比表面能（ 如表面张力、表面自由能等） 和表面微形貌的关系和影响细胞反应的重要因素上。成骨细胞与材料的相互反应依赖于这些材料表面特征，它们决定了生物分子如何吸附到表面上，并且决定了吸附分子取向性，细胞接触时的行为； 而粘附过程取决于最先吸附的粘附蛋白。作为细胞与材料接触的第一步，成骨细胞粘附是促进分泌胞外基质蛋白、诱导无机成分沉积，调控骨组织形成、吸收、改建的基础[2].粘附行为将影响细胞的形态以及细胞增殖分化的能力[3],表面越粗糙，比表面积越大，表面能也越高，表面羟基团越多，这可在钛表面产生更多的表面活性点和更高的热力学反应潜力，吸附更多的纤连蛋白大分子[4].
多项研究证明具有微米或纳米结构的表面微结构，其亲水性能在增强细胞反应过程中发挥了重要作用，从而获得更强的细胞分化能力和成骨细胞产生局部因子的能力[5-6].生物材料在植入人体后先与体液相接触再与体液中的组织细胞相接触。材料润湿性愈好，亲水性愈高，体液在材料表面铺展渗润性愈好，分子间反应面积愈大，血液和体液细胞在材料表面接触机会愈多，愈利于细胞的紧密附着，界面的细胞亲和性愈强。体外研究显示了亲水性改良大颗粒喷砂酸蚀表面在接触全血时凝结血小板从而加快凝血块的形成[7].多项研究认为一定范围内的粗糙度增加能使材料比表面积增大，从而表面活性反应位点增多、局域内电荷密度提高、极性分量增大，都有利于细胞表面极性分子配体蛋白的吸附反应，从而促进细胞粘附； 但同时表面粗糙度的变化影响着润湿性改变甚至下降，所以只有当粗糙度和润湿性达到良好匹配性时材料表面才有利于发挥良好的促细胞黏附效应[8-10].组织工程支架材料领域的研究一般认为细胞在中等润湿的材料表面粘附能力最强[11].研究认为表面润湿性可间接表征材料表面能，高能材料表面生物大分子物质更易吸附，弯曲变形、增加附着点，并形成很好的细胞附着前体物，因此有利于生物附着[12].
本研究处理组钛片经喷砂酸蚀处理后生理盐水中储存，经过 γ 射线（ 25. 0 kGy,12 h） 辐照消毒以保持该处理后的亲水活性表面，过程中避免空气中暴露的时间。处理组静态水接触角接近零，与单纯的喷砂酸蚀表面静态水接触角相比，显示了改良亲水性表面润湿性的变化。本实验粘附率结果显示2 h 时对照组高于处理组，除去润湿性和粗糙度等原因，在研磨抛光钛表面上可形成接触诱导加快成骨细胞粘附，而且表面越粗糙，表面的沟槽和峰嵴越明显，成骨细胞也越容易形成接触诱导从而引起成骨细胞更快附着[13].有研究显示光滑钛片早期粘附高于喷砂-酸蚀表面[13-14].而 4 h、8 h 时处理组粘附率高于对照组。Bigerelle[15]认为，抛光表面不能提供所需的间断特征或提供的间断特征的幅值、频率太小以至于不允许细胞取向或不适于粘附。处理组因其润湿性高及粗糙程度适中介导了成骨细胞更多的附着。这一点可能在早期与对照组的接触诱导作用相比表现的不明显，在4 h 后反应较明显。本实验结果显示 8 h 时 C 组粘附率低于 A 组和 B 组。粗糙度更大的表面、表面不规则度较大、分维数大、表面热力学分布不均等不利于蛋白和细胞的接触，最终导致 C 组较中度粗糙的 A、B 组的粘附率低。
本实验中，2 h 时可见处理组细胞均呈圆形或椭圆形，而对照组细胞呈平铺状。细胞在对照组光滑钛表面发生取向性生长，而在处理组表面发生无取向性生长。细胞在材料表面生长取向受材料表面形貌调控，对照组细胞取向性生长为沟槽的导向性所致。处理组 4 h 时伸出突起，8 h 时立体伸展明显；然而对照组一直呈现为薄薄的单层。扫描电镜结果展现了不同粗化表面决定了细胞粘附后的形态。
Boyan[16]研究证明，一定的粗糙表面使附着的成骨细胞伸出伪足跨过突起的峰嵴，形成悬吊的桥梁结构，而光滑表面附着的成骨细胞扁平伸展。本研究粘附率结果与扫描电镜结果结合，亲水性中度粗糙表面的 A 组、B 组细胞表现了良好的粘附及伸展形态以及较高的粘附率，反映了该表面特性可能更利于细胞的粘附。良好的润湿性和中度粗糙表面，更有利于发挥良好的促细胞粘附效应。
