克隆技术论文第四篇：DNA克隆技术在枣实蝇快速鉴定中的应用
摘要：利用DNA克隆技术， 首次克隆了检疫性害虫--枣实蝇不同地理种群mtDNA COI基因从M7至COOH之间的片段， 从而初步建立了枣实蝇的基因片段库， 为枣实蝇的分子生物学鉴定和分子系统发育等相关研究提供数据。
关键词：枣实蝇；检疫性实蝇；克隆；基因；
作者简介：程晓甜 （1988-） , 女， 硕士， 从事林业有害生物检疫研究， Email:chengxiaotian8862@163.com;阿地力·沙塔尔， Email:adl1968@126.com;
Abstract:Using DNA cloning technology, we first cloned the fragment of mtDNA COI gene from M7 to COOH of different geographical populations of quarantine pest-Carpomya vesuviana, and initially established the gene fragment library of Carpomya vesuviana, which is the molecular biology of Carpomya vesuviana.Identification and molecular phylogeny and other related research to provide data.
Keyword:Carpomya vesuviana; Quarantine; cloning; gene;
枣实蝇 （Carpomya vesuviana Costa） 是全国林业检疫性有害生物， 是一种十分危险的新入侵的害虫。2007年， 首次在新疆吐鲁番地区发现的重大检疫性害虫， 系在新疆乃至全国枣产业上有着重要经济意义的害虫。在2007年5月29日发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中把枣实蝇列为我国禁止进境的检疫性入侵害虫 （中华人民共和国农业部公告， 2007） [1,2,3,4].枣实蝇属双翅目 （Diptera） 实蝇科 （Tephritidae） 实蝇亚科 （Trypetinae） 实蝇族 （Trypetini） 咔实蝇属 （Carpomya Costa） .随着中国经济的高速发展， 国内地区间和国际的商业贸易与人员往来日渐频繁， 造成枣实蝇的扩散概率越来越高。然而枣实蝇一旦入侵新的区域， 往往会给入侵地的枣产业带来严重的后果， 甚至是毁灭性的打击。因此， 在枣产业安全与植物检疫中枣实蝇的检疫鉴定愈来愈重要[5,6].
本研究首次利用DNA克隆技术， 将枣实蝇mtDNA COI基因以菌液形式长期保存， 当需要时可以取出培养提取质粒， 解决了在口岸实蝇鉴定中国外获取标本困难， 或缺乏阳性对照的难题， 为枣实蝇快速鉴定提供了材料。
1 材料与方法
1.1 试验材料
枣实蝇蛹标本分别采自4个地区：吐鲁番市、KSS、HSX和HMS, 其采集地， 个体数量及采集时间见表1.
表1 不同枣实蝇种群的标本采集地点、个体数量以及采集时间
1.2 试验方法
1.2.1 目标片段常规PCR扩增
枣实蝇mtDNA COI基因目标片段用引物Uea7和Uea10进行PCR扩增获得， PCR反应体系：PCR扩增在定量梯度PCR仪上进行， 反应体系：10×Buffer2.5μl, Mg2+2μl, dNTP 2.5μl, 上下游引物各0.2μl, 1 UTaq酶 （Takara） 0.2μl, 模板DNA2.5μl, 加水至总体积25μl.
PCR扩增条件：94℃/5 min, 95℃/40sec, 48℃/30sec, 72℃/1min, 30个循环， 最后72℃延伸7min.取PCR产物5μl在含溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶上电泳30min （90V） , 在数字图像分析仪上检测结果[6,7,8].
1.2.2 PCR产物纯化
将50μl左右的DNA样品用含溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶上电泳30 min （90V） 电泳分离， 电泳缓冲体系为TBE.回收DNA （片段大约为700bp） ;采用宝生物工程 （大连） 有限公司生产的Takara Agarose Gel DNA Purfication Kit Ver.2.0code DV805A纯化目的条带。回收DNA溶于25μlElution Buffer中。
1.2.3 载体连接
将纯化的PCR产物与pGM-T载体 （大连宝生物公司） 连接， 操作按说明书进行， 其中目的PCR片段7μl, pGM-T载体1μl, 10×T4DNA Ligation Buffer 1μl, T4DNA Ligase （3U/μl） 1μl, 16℃过夜连接。
1.2.4 转化
将5μl连接液加入到50μl新鲜制备的感受态细胞进行转化；将细菌涂布在90mm平板上， 在制平板之前1LLB培养基中加100μlIPTG （50mg·mL-1） 和200μl 20 mg·mL-1 X-gal, 细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整；平板在37℃下正向放置半小时以吸收过多的液体， 然后倒置培养过夜。
1.3 检测
1.3.1 常规检测
重组克隆筛选一蓝/白斑筛选， 当外源DNA片段插入到pGM-T中后， 由于外源DNA的核酸序列在改变了LacZ基因的编码， 从而影响了其产物β一半乳糖苷酶ɑ片段的活性， 因此重组克隆X-gal/IPTG平板上呈现为白色， 而非重组克隆呈蓝色[7].
从平板中挑4个白斑克隆， 置于4 mL LB-AMP培养基中， 37℃， 150rpm过夜培养。采用宝生物工程 （大连） 有限公司生产的TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提质粒， 用Elution Buffer中溶解DNA, PCR法进行阳性克隆的筛选。采用的引物用UEA7和UEA10, PCR产物约700bp.与克隆前PCR产物的大小一致， 确定为阳性克隆。
1.3.2 酶切反应
在10μL反应体系中加入5μL质粒， 酶ECORI 1μL, 10×buffer1μL, 最后加ddH2O至10μL, 将上述混合液置37℃水浴4h.
1.3.3 快速检测
挑取白色菌落直接进行PCR检测。
1.3.4 测序鉴定
使用常规检测或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。
2 结果与分析
2.1 枣实蝇mtDNA COI基因片段克隆
本研究对四个地区枣实蝇的线粒体DNA细胞色素氧化酶I （COI） 从M7至COOH之间约700bp片段部分序列进行克隆， 分别获得克隆片段的菌液和质粒， 菌液和质粒均保存于-20℃。
2.2 DNA克隆片段常规PCR检测
用四个地区枣实蝇的DNA克隆片段的质粒直接作为模板， 用引物Uea7和Uea10进行常规PCR检测， 以检查克隆片段的大小， 检测结果如图所示：可以看出500~750bp之间大约700bp目标片段的位置有一条扩增带， 亮度差异表示模板浓度的差异。DNA确切浓度和纯度通过核酸蛋白检测仪来测定。见图1.
图1 Uea7/Uea10引物PCR模板DNA质量电泳图
M:DL2000DNA Marker;1:HSX枣实蝇， 2:HMS枣实蝇， 3:吐鲁番市枣实蝇， 4:KSS枣实蝇
2.3 酶切反应
用酶ECORI进行酶切反应， 取酶切产物5μl在含溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶上电泳30min （90V） , 结果如图2所示：
图2 酶切电泳图
M:DL2000DNA Marker;1:HSX枣实蝇， 2:HMS枣实蝇， 3:吐鲁番市枣实蝇， 4:KSS枣实蝇
3 讨论
在枣实蝇快速鉴定上枣实蝇克隆片段具有很大的应用价值， 在对未知的实蝇标本任何虫态 （无论是成虫还是卵、幼虫、蛹） 在进行快速鉴定时， 阳性对照可用枣实蝇的COI基因克隆质粒， 而含枣实蝇mtDNA COI基因的菌液可以长期保存， 当需要时可以取出培养提取质粒。这样就解决了在口岸实蝇鉴定中国外获取标本困难、或是缺乏阳性对照的难题， 同时也为能够进行大规模的SYBR Green PCR实时荧光检测提供了充足的实验材料[6,7,8,9].
参考文献
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