浅析现阶段高通量测序中的拼接问题(2)

　　（2）步骤
　　
　　筛选reads:对reads进行检测，去除掉可能错误的reads---确定k值：k的值直接影响速度和精度。 K值较大时，精度有所提高，但更容易受覆盖率的影响。故应该根据覆盖率、reads长度等确定合适的k值---处 理DBG:根 据 确 定 的k值，做 出DBG,同时完成化简和修正---根据DBG,拼接成contig.
　　
　　（3）优缺点
　　
　　DBG算法在处理海量短reads的时候效果优秀，与现在测序技术的发展趋势相匹配。然而，由于k-mer的长度较短，此方法受重复序列、测序错误的影响较大。
　　
　　（三）不同拼接软件的效果差异
　　
　　不同的拼接软件在reads拼接过程中表现为三点：一是比起软件来说，reads质量对拼接结果影响更大；二是与标准序列的接近度随reads和拼接软件的不同有很大改变；三是各软件拼接的正确率差别很大，但与接近度的结果不一致。
　　
　　四、Contigs的组装
　　
　　与reads的拼接相比，contigs的组装的难度相对较小。这是因为contigs的长度较reads长很多，所含信息较多。故可以较为准确的组装成scaffold
　　
　　（一）组装过程的难点[4]
　　
　　Contigs组 装 过 程 中 的 难 点 主 要 有 二。一 是contigs中 含有大量的重复序列，不易确定contigs之间的相对顺序；二是由于contigs由reads拼接而成，其中不 免 会 有 一 些 错 误，这 些 错 误 也 会 对contigs的组装产生干扰。
　　
　　（二）方法
　　
　　Contigs组 装的方法较reads拼 接而言较多，一般常用的有图论法和光学图谱法（Optical mapping）两种。
　　
　　1.图论法[5]
　　
　　图论法是比较传统的方法，与reads拼接有相似的地方。它以contigs作为节点，由相连的读取对（Linking reads pair）作为边，由此形成算图。
　　
　　其一般步骤为：库的构建：构建出含有所有reads的 库---计算相连读取对之 间的距离，并由此计算gap的长度---把长度放在边上，作为算图的数据。
　　
　　其理想的输出结果是一条scaffold序列，对应一条染色体，包含以正确顺序排 列 的contigs和contigs之间gap的长度。
　　
　　2.光学图谱法[6]
　　
　　光学图谱法是一种较为新颖的方法。通过内切酶将DNA切断，此时DNA片段的谱表现出一种特殊的指纹或是识别码的性质。利用光学方法追踪此信息得到相对位置，由此组装成正确的scaffold.
　　
　　主要步骤为：将contigs放 置 在 光 学 图 谱上---修正光学图谱---做出contigs的连接图，由此决定最佳的contigs连接顺序。
　　
　　光学图谱法的组装结果有着很高的覆盖率，巧妙运用光学图谱法可以获得很高的成本效益。
　　
　　有研究表明，当与454平台获得的实验结果相结合的时候，光学图谱法可以迅速、价廉的得到排列好的定向的contigs组，由此可以产生一个将近完整的基因组。
　　
　　（三）发展方向
　　
　　Contigs组装过程的关键点 在于如何得到正确的连接顺序。现阶段此方面研究多集中在这一方向。
　　
　　五、前景与展望
　　
　　随着生物学研究向微观、向基因领域逐步延伸，高通量测序作为获得基因序列的主要方法，越来越受到重视，拼接技术也在不断发展。高通量测序的基因片段会变得海量且短小，应对此变化，拼接技术也会由确定“唯一的基因序列”向确定“最可能的基因序列”完成转变。因此，新一代的拼接技术会在准确率、覆盖率和速度上，作出超于现在拼接技术的改进。
　　
　　参考文献：
　　[1]Anderson MW, Schrijver I. Next Generation DNASequencing and the Future of Genomic Medicine.?Genes.2010;1（1）：38-69. doi:10.3390/genes1010038.
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　　[3]Deng X, Naccache SN, Ng T, et al. An ensemble strategythat significantly improves de novo assembly of microbialgenomes from metagenomic next -generation sequencingdata.Nucleic Acids Research. 2015;43 （7）：e46. doi:10.1093/nar/gkv002.
　　[4]Latreille P, Norton S, Goldman BS, et al. Opticalmapping as a routine tool for bacterial genome sequencefinishing.BMC Genomics. 2007;8:321. doi:10.1186/1471 -2164-8-321.
　　[5]Hunt M, Newbold C, Berriman M, Otto TD. Acomprehensive evaluation of assembly scaffolding tools.Genome Biology. 2014;15 （3）：R42. doi:10.1186/gb -2014 -15-3-r42.
　　[6]Nagarajan N, Read TD, Pop M. Scaffolding andvalidation of bacterial genome assemblies using opticalrestriction maps.Bioinformatics. 2008;24 （10）：1229 -1235.doi:10.1093/bioinformatics/btn102.