黑质网状部( substantia nigra pars reticulata,SNr) 是基底神经节的重要输出核团之一,在运动行为的维持和运动调控方面发挥重要作用。已有研究发现 SNr 内含有大量的 γ - 氨基丁酸( gamma -aminobutyric acid,GABA) 能神经元,根据其含有钙结合蛋白种类的不同分为三种亚型,即小清蛋白( Parvalbumin,PV) 、钙结合蛋白 - D28K( Calbindin - D28K,CB) 以及钙视网膜蛋白( Calretinin,CR) 。其中含有 PV 的神经元亚型在 SNr 内大量存在,并且大多属于 GABA 能投射神经元,分布于 SNr 的信息输出区域,与基底神经节的信息输出以及感觉运动功能密切相关。因此本研究采用免疫组织化学染色方法观察运动疲劳及恢复阶段大鼠SNr 内PV 表达水平的变化,以期揭示PV是否参与了运动疲劳过程中重要运动调控脑区神经元的信息调节过程。
1、 材料与方法
1. 1 实验动物及分组
实验选择清洁级健康雄性 SD 大鼠 24 只,体重 200 ±20g,适应性饲养 2 天后将大鼠随机分为对照组( CG) 和运动组( EG) 。其中 EG 又分为即刻组( 0EG) 、24h 组( 24EG) 和 48h组( 48EG) ,每组6 只。
1. 2 疲劳运动模型的建立
本试验室参照 Bedford方法修改建立了三级递增负荷跑台运动方案。动物先进行3 天适应性跑台训练,从第4 天开始正式跑台运动,负荷分为三级,每级跑速分别为 8. 2m/min、15m / min、20m / min,第Ⅰ、Ⅱ级分别运动 15min,第Ⅲ级运动直至力竭,运动周期为7 天。对照组动物相同条件下常规饲养,不进行跑台运动。
1. 3 PV 免疫组化染色
大鼠经水合氯醛麻醉后,开胸经左心室灌流生理盐水200ml 冲洗血液,再用冰冷的 4% 多聚甲醛灌注 5 - 10min。灌流完毕后立即取脑,置于 4% 多聚甲醛中后固定 4h,随后将脑转移到30%蔗糖溶液中直至沉底。切制 50um 厚的冠状冰冻切片,收集于0.1mol/L 磷酸缓冲液内,按下述步骤进行 PV 免疫组织化学染色: 切片置于3%H2O2 中室温封闭 20min; 3%马血清室温封闭30min; 一抗室温孵育2h; 二抗室温孵育 2h; ABC复合物结合反应2h; DAB 显色剂显色20min。然后将切片贴于涂有明胶的载玻片上,脱水透明,加拿大中性树脂封片。
1. 4 图像分析与数据处理
采集 SNr 核团的 PV 免疫染色图像,分别从四组大鼠 SNr核团相同层面的连续脑片中选取6 张脑片进行统计,用图像分析软件 Image Pro Plus( Media Cybernetics 公司) 分别计算其阳性细胞面密度值和阳性纤维染色的消减平均灰度值( 背景物平均灰度与阳性物平均灰度之差) 作为统计对象,所得结果均用平均数 ±标准误( Mean ± SEM) 表示。应用 SPSS16. 0 统计软件进行分析,P <0.05 表示组间有显著性差异; P <0. 01 表示组间有极其显著性差异。
2、 结果
DAB 染色结果显示,PV 阳性标记集中分布于 SNr 外侧部约2/3 区域。经过统计分析,CG、24EG 和 48EG 三组大鼠 PV阳性细胞平均面密度均显著性高于 0EG 组( P < 0. 05,P < 0.01) ( 见图 1) 。阳性纤维消减灰度值组间比较结果表明,0EG大鼠纤维表达水平较 CG 大鼠显著下降( P < 0. 01) ,恢复至24h,纤维表达水平没有显著的回升,仍显著低于 CG 大鼠( P <0. 01) 。当恢复到 48h 时,PV 阳性纤维表达水平与 0EG、24EG相比有显著增强( P <0.01; P <0. 01) ,基本恢复到运动前对照组水平( P >0.05) 。
3、讨论
Rodríguez 和 González - Hernández 研究发现,从黑质投射到丘脑和纹状体的 GABA 能投射神经元,大部分都具有高频放电的特性,并且存在 PV 阳性表达。SNr 是基底神经节主要的输出核团之一,是纹状体信息传入的主要靶核团,SNr 外侧区主要接受来自于纹状体腹外侧区即纹状体接受感觉运动皮层信息输入区域的神经投射。West 等人研究发现,纹状体中与肢体运动相关的神经元位于其腹外侧区。本实验结果显示,CG 大鼠 SNr 内 PV 阳性细胞和纤维遍布于 SNr 外侧约2/3 区域,与以往的研究报道一致。运动疲劳后,SNr 内PV 表达水平在短期内显著下降,恢复 24h 后明显回升,并随着恢复时间的延长逐渐达到对照组水平,揭示 SNr 内 PV 参与了运动疲劳产生的神经生物学调控。
虽然目前 SNr 内 PV 的确切功能还尚不清楚,但在神经系统内有关 PV 的研究表明,其主要参与调节和缓冲胞内钙离子浓度,并且在实现钙离子与其它第二信使之间的相互联系中发挥重要作用。由此推测,运动疲劳后SNr 神经元钙离子浓度的变化也可能与 PV 阳性表达短时间内缺失有关。此外,PV在神经系统内的生物学作用非常广泛,如神经递质的释放、酶的活性、神经电活动等。综上所述,PV 参与了多种神经生物学调控和功能的维持,其表达的缺失可以导致神经系统疾病和运动行为的异常; 运动疲劳导致 SNr 内 PV 阳性神经元和纤维的表达在短时间内显著性的下降,可能也会影响该脑区 GABA能神经元的放电活动,继而影响基底神经节对皮层运动区的神经信号调控。
