糖尿病患者动脉粥样硬化性心脏病的发病率较非糖尿病患者明显增加， 且呈现加速进展态势， 其形成的确切机制尚未完全清楚。 研究表明： 糖尿病患者体内晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products， AGE） 的形成和不断 累积与动脉粥样硬化的发生和发展关系密切。 动脉粥样硬化 （AS）病变始于内皮损伤， 而 AGE 可作用于细胞表面特异性受体RAGE （receptor of AGE） ， 使内皮细胞凋亡增多 、 增生减少 ；诱导发生氧化应激， 产生自由基导致氧化损伤、 血管收缩和促凝血状态、 刺激细胞因子等释放， 加剧血管壁的炎症过程发挥其致动脉粥样硬化的效应。 如何延缓甚至逆转糖尿病加速 AS的发展进程是近来研究的热点。 黄芪注射液为中药黄芪提取物制成的针剂， 其主要成分黄芪多糖 （astragalus polysaccharides，APS） 可双向调节血糖及增强机体 免疫功能 ， 对糖尿病心血管并发症如 AS 的发生发展也有一定的保护作用。 本研究旨在观察体外培养环境下黄芪是否具有保护晚期糖基化终产物诱导内皮细胞凋亡效应的作用及可能的机制。
1、 材料与方法
1．1 主要材料
黄芪注射液由成都地奥制药公司生产， 规格 1 g／mL。 内皮细胞基础培养基 （EBM－2） 购于 Lonza 公司。 胎牛血清 （fetalbovine serum， FBS） 购 于 Gibco 公 司 。 ROS 荧光检测试剂盒（Image－iT LIVE Green ROS Detection Kit） 购于 Molecular Probes公司。 DMSO、 N－乙酰－L－半胱氨酸 （NAC） 购自 Sigma 公司。人凋亡因子 FAS ELISA 试剂盒购于 R＆D 公司。 MTS 检测试剂盒购于美国 Promega 公司。 其它试剂为国产分析纯。
1．2 体外制备晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白
人血清白蛋白 （HSA） 0．2 g， D－葡萄糖 3．0 g 共溶于 10mL 0．5× 磷酸盐缓冲液 （PBS） 中 （pH 7．4）， 使 HSA 终浓度为20 g ／ L， D－葡 萄糖为 1．67 mol ／ L， 室 温下搅拌 5 h， 用 孔径为0．22 μm 的针头滤器过滤灭菌后 ， 封装置于 37 ℃ 恒温箱孵育90 天后取出， 于 20 mmol ／ L PBS 中充分透析后备用 。 用 Brad-ford 法检测 AGE 浓度。
1．3 内皮细胞培养
原代人冠状动脉内皮细胞 （HCAECs） 购于 Cell applica-tions 公司。 培养液为含 10％ FBS 的 EBM－2 培 养基 。 经 0．25％胰蛋白酶和 0．01％的 EDTA 混合液消化 10 分钟， 离心后用少量培养基重新悬浮， 转入 5％ CO2培养箱中进行原代培养， 培养3 ～ 4 天 后更换含有 10％的 FBS、 青 霉素 100 u ／ mL 及 链霉素100 u ／ mL 的 EBM－2 培养液， 待细胞生长融合达 80％后， 胰酶消化、 传代。 取第 3 ～ 4 代细胞用于实验研究。
1．4 细胞增殖测定
按照美国 Promega 公司 MTS 检测试剂盒说明书操作。 收集处于对数生长期的细胞， 以含 10％的胎牛血清的 EBM－2 培养基稀释至 1 × 105／ mL， 接种至 96 孔细胞培养板， 每孔接种 0．1mL 培 养过夜 ， 使细胞贴壁 ， 按既定方案分组 ， 孵育 24 h 后 ，每孔加入 20 μL 的 MTS 溶液， 37 ℃， 5％ CO2培养箱温育 4 h，用酶标仪测定 490 nm 波长处的吸光值， 计算细胞增殖率。
1．5 激光共聚焦检测细胞内氧自由基 ROS 变化
按照 Image－iT LIVE Green Reactive Oxygen Species Detec-tion Kit 说明书操作 。 简要操作方法 ： 移除细胞培养基 ， 37 °CPBS 中 清洗细胞 3 次 ， 每 次 5 分 钟 ， 防止细胞脱落 ； 配制 25μM carboxy－H2 DCFDA ＋ 1．0 μM Hoechst 工 作液 ， 300 μL 覆 盖细胞， 湿润环境下培育 30 分钟， 室温， 避光。 在 PBS 中清洗细胞 3 次， 每次 5 分钟。 甘油封片， 激光共聚焦显微镜检测。
1．6 FAS ELISA 检测
取各组细胞培养液上清用于 FAS 检测。 操作按 R＆D 公司FAS ／ CD95 ELISA 试剂盒说明， 用酶标仪在 450 nm 波长依序测量各孔的光密度 （OD 值）。 每次实验每组设 3 个复孔， 重复 3次。 用 Curve Experts 1．3 软件算出对应浓度。
1．7 统计学分析
实验结果用均数 ± 标准差表示， 采用 SPSS 18．0 统计软件包进行单因素方差分析， 以 P ＜0．05 为差异有显著性。
2、 结果
2．1 黄芪对 AGEs 诱导内皮细胞凋亡的影响
将 HCAECs 以 2 × 106细胞 ／mL 接种至 60 mm 培养皿中，将培养至融合状态的细胞分组： 正常对照组、 AGE 损伤组 （终浓度为 5、 10、 20、 40 mg／L）。 经过单因素方差分析发现： 与空白组相比， 终浓度为 5 mg／L AGE 即可使细胞明显损伤 （P ＜0．05） （图 1A）。 选择损伤较明显的 AGE 20 mg ／ L 组 ， 30 min后予加低、 中、 高浓度黄芪干预 （其中 APS 终浓度分别为100、 200 和 400 mg ／ L）。 结果表明： 与 AGE 20 mg ／ L 组相比 ，中、 高浓度黄芪组细胞存活明显升高， 经统计有显著差异 （P＜0．01） （图 1B）。
2．2 黄芪通过抑制 AGEs 诱导的内皮细胞氧化应激
如图 2 所示： 与对照组 （A） 相比， AGE 可明显诱导 ROS水平 （B）， 但其作用可被黄芪注射液抑制 （C）。
2．3 黄芪多糖对人凋亡相关因子 FAS 水平的影响
如图 3 所示： AGE 20 mg／L 组 FAS 水平明显升高， 中浓度黄芪组即可降 AGE 诱导 FAS 的水平 （P ＜0．05）； 在 400 mg／L浓度最明显， 且与 ROS 通路抑制剂 30 mM NAC 组比较， 差异无显著性 （P ＞0．05）。
3、 讨论
血管内皮细胞在血管稳态平衡中有重要作用， 易受到炎性介质损伤引起血管内皮功能障碍。 内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化形成的早期始动环节， 如何早期、 有效保护内皮细胞凋亡，对于延缓甚至逆转动脉粥样硬化的发生发展具有重要的临床意义。 本实验研究发现： AGE 修饰的人血清白蛋白可以诱导血管内皮细胞凋亡， 呈浓度依赖， 而中、 高浓度黄芪多糖可以抑制该作用； 黄芪多糖可下调 AGE 诱导的 ROS 水平； AGE组可促使血管内皮细胞 FAS 分泌明显升高， 中、 高浓度黄芪多糖可降低 AGE 诱导 FAS 的水平， 在 400 mg／L 浓度最明显， 且与 ROS 抑制剂 NAC 比较差异无显著性。
大多糖尿病患者只关注血糖的水平， 而对危害较大的糖尿病血管并发症却未有足够的重视。 糖尿病血管并发症的发病机制较为复杂， 存在多个环节和靶点， AGE 及其受体 RAGE 可能是加速动脉粥样硬化进展的关键环节， 其具体机制可能与促进内皮功能不全、 诱导的血管内皮通透性增加、 促单核细胞迁移入血管内膜、 诱导内皮祖细胞凋亡和抑制其迁移、 促进氧化应激因子的过表达、 特别是增加内皮细胞的凋亡等有关。 细胞凋亡是受细胞内基因及细胞外因子调控的一种细胞主动死亡方式。 人凋亡相关因子 FAS 被称为死亡受体， 广泛表达于机体多种组织细胞表面， 发挥着促进细胞凋亡的作用， 是当前在细胞凋亡实验中应用较广泛、 作用较明确的指标， 其高表达可促进细胞凋亡的发生。 本研究亦证实较高浓度的 AGE 可导致内皮细胞凋亡， 并上调 FAS 的表达。
黄芪注射液为中药黄芪提取物制成的针剂， 主要成分为黄芪皂甙、 黄芪多糖、 氨基酸等， 具有多成分与多靶点作用的特点。 我们既往研究表明， 黄芪多糖可以通过抑制丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶－1 （MKP－1） 及单核细胞趋化因子－1 （MCP－1）水平的增高， 逆转高糖导致的血管平滑肌增殖。 此外亦有研究表明黄芪可以增加高葡萄糖培养的 EPCs 数量及改善其增殖能力， 并能减轻高葡萄糖对 EPCs 向内皮细胞系分化的抑制作用， 可 以通过阻断 ROS、 NF－κB 途径抑制肿瘤坏死因子（TNFα） 诱导的黏附因子 ICAM－1 及 VCAM－1 表达。
我们的研究表明， 黄芪可以通过 ROS 通路降低 AGE 诱导凋亡相关因子 FAS 的水平， 有望提供了一条临床防治糖尿病血管并发症的新途径及理论基础。
