光化学损伤是视网膜光损伤中最普遍的一种损伤，其病理过程与年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病有许多相似之处，主要表现为视网膜光感受器细胞的凋亡，是一个退行性变性过程。氨基酸也是视网膜中一类重要的神经递质。研究发现，视网膜兴奋性氨基酸的过量可导致兴奋毒性作用，引起视网膜神经元的死亡。光损伤可以引起视网膜多种游离氨基酸含量增高，故检测氨基酸类神经递质含量的变化对于了解视网膜光损伤的发病机制有重要的参考价值。目前研究发现，叶黄素与玉米黄质共同构成视网膜黄斑色素，且存在于整个视网膜，是人眼中唯一存在的两种胡萝卜素。国内外研究表明:叶黄素与玉米黄质均能够预防眼睛光损伤。本研究通过建立大鼠视网膜光损伤模型，在前期重点研究叶黄颗粒(主要含叶黄素和玉米黄质，叶黄素与玉米黄质的比例为5:1)对视网膜光损伤的防护作用及作用机制基础上，进一步了解叶黄颗粒对光损伤大鼠视网膜及血清游离氨基酸水平的影响，为将来研制开发更加安全、有效、方便的防治视网模光损伤的新制剂，提供新的研究思路及一定的理论依据。
1 材料与方法
1．1 实验
动物雄性SD大鼠48只，体重190g～230g，8周龄，清洁级，由浙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号:SYXK(浙)2008－0115)。
1．2 实验药品
叶黄颗粒由荷兰帝斯曼(DSM)公司提供，叶黄颗粒含叶黄素(lutein)含量为10%，玉米黄质(zeaxanthin)含量为2%(lutein:zeaxanthin的比例为5:1)，制剂辅料主要为淀粉。
1．3 实验分组及给药
将48只大鼠随机分为6组，每组8只，分别为:空白对照组;模型对照组;阳性对照组;叶黄颗粒低剂量组;叶黄颗粒中剂量组;叶黄颗粒高剂量组。试验前将叶黄颗粒制剂采用蒸馏水配置，灌胃剂量1ml/200gBW，每日1次。试验期间，空白对照组给予蒸馏水，不光照;模型对照组给予蒸馏水，接受光照;叶黄颗粒低剂量组给予叶黄颗粒5mg/kgBW，叶黄颗粒中剂量组给予叶黄颗粒25mg/kgBW，叶黄颗粒高剂量组给予叶黄颗粒50mg/kgBW。连续给药7d后造模，造模后继续给药7d后，0．3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，断髓处死。
1．4 大鼠视网膜光损伤模型的建立
参考Noell等报导的方法，建立大鼠视网膜光损伤动物模型。光照箱制备:自制长(1m)x宽(1m)x高(0．5m)的光照箱，无面均装有日光灯管，箱内照度经数字式光照度计(北京师范大学光电仪器厂产品)测定为3000lux±200lux，箱内温度控制在22℃～25℃。模型制备:所有实验用大鼠均在12h明(20～50)Lux以及12h暗的循环光环境下适应7d，实验组在光照前暗适应36h，然后放入光照箱，接受24h持续光照，光照完成后大鼠置于暗室。光照箱6面放置一根白色冷光源荧光灯管，动物可自由饮水和获得食物。
1．5 方法
1．5．1 视网膜匀浆的制备
大鼠光照后7d，0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后取出眼球，解剖显微镜下，于冰台上剥取鼠眼视网膜，用滤纸吸去表面液体，加生理盐水，充分研磨制成10%匀浆，冷冻离心机离心3500r/min×15min，取上清液用作生化检验。
1．5．2 大鼠血清的制备
大鼠光照后7d，称重，腹腔注射0．3%戊巴比妥钠0．2倍体重剂量麻醉，麻醉后眼球取出后，用10ml注射器下腔静脉取血，置于5mlEppendorf管中静置2h，以3000r/min的转速离心15min，取上层血清于1．5mlEppendorf管中备用，放入－20℃冰箱中。
1．5．3 游离氨基酸含量测定
1．5．3．1 样品处理
血清样品:准确吸取0．6ml血清样品于1．5ml离心管中，加入0．4ml10%磺基水杨酸溶液，摇匀后，14000r/min离心20min，取上清液过0．22μm滤膜后上机测定。视网膜样品:准确称取样品0．2g左右于1．5ml离心管中，加入1．00ml10%磺基水杨酸溶液，超声破碎后，14000r/min离心20min，取上清液过0．22μm滤膜后上机测定。
1．5．3．2 仪器参数
氨基酸分析仪采用生理体液分析系统，主要色谱条件:色谱柱采用日立2622阳离子交换树脂(PartNO．855－3693)，4．6mm×60mm(PartNO．855－4507)，洗脱方式为四梯度洗脱，由计算机控制。柠檬酸缓冲液为洗脱液，流速0．35ml/min，茚三酮为显色剂，显色剂溶液流速0．3ml/min。以570nm和440nm波长同时检出，样品分析周期148min;进样体积20μl，数据由计算机处理。
1．6 统计方法实验
结果以x珋±s表示，用SPSS1310软件进行统计分析，各组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用最小显著差异法Student’st－test检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。
2 结果
2．1 叶黄颗粒对大鼠视网膜游离氨基酸含量的影响
光照后7d，本实验共检测分析了视网膜包括牛磺酸在内的20种游离氨基酸。模型对照组及各治疗组大鼠视网膜中Glu、Asp、Gly、GABA、Tau5种神经递质类游离氨基酸含量均升高，模型对照组与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0．01);与模型对照组比较，叶黄素颗粒高、中、低剂量组及阳性对照组含量有不同程度降低，大部分差异均具有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01)。其余Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His、Arg、Ser、Ala、Cit、Cys、Tyr及Orn15种必需和非必需氨基酸，模型对照组及各治疗组大鼠视网膜中其含量也均升高，模型对照组与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01);与模型对照组比较，叶黄素颗粒高、中剂量组及阳性对照组中上述15种氨基酸(Orn除外)含量有不同程度降低，大部分差异均具有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01)，低剂量组有降低趋势，但大部分无统计学意义(P＜0．05);各治疗组与模型对照组比较，Orn含量差异无统计学意义(P＜0．05)(表1，表2)。
2．2 叶黄颗粒对大鼠血清游离氨基酸含量的影响
光照后7d，本实验同时还检测分析了大鼠血清中上述20种游离氨基酸。统计结果表明，各组间20种氨基酸含量差异无统计学意义(P＞0．05)(表3，表4)。
3 讨论
氨基酸不仅是生物体中的营养物质和代谢产物，它们在神经系统中还发挥着某些重要的生理功能，氨基酸是视网膜中一类重要的神经递质。根据其对中枢神经元的不同可分为:兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸。Glu、Asp、GABA、Gly均为经典神经递质，且属氨基酸类神经递质。Glu、Asp是主要的兴奋性神经递质，GABA、Gly则是主要的抑制性神经递质。研究证实，Glu是包括光感受器细胞、双极细胞和神经节细胞在内的视信号传导通路的主要兴奋性神经递质，Asp在中枢神经系统中也是主要的兴奋性神经递质，在神经元损伤等生理病理过程中起关键作用。GABA是中枢神经系统的主要抑制性神经递质，调节和控制正常的生理功能。正常情况下，视网膜中GABA刺激GABA受体而阻断Glu的兴奋毒性，使视网膜的抑制性神经递质和兴奋性神经递质保持平衡。Tau是视网膜中含量最高的氨基酸，几乎占视网膜中游离氨基酸的50%，Tau在维护视网膜的结构和功能上具有重要作用。其中之一就是保护视网膜感光细胞免受光化学损伤，其次Tau对Glu诱发的去极化现象有抑制作用，并在一定程度上拮抗谷氨酸引起的钙离子内流。故测定这些氨基酸类神经递质含量变化对于视网膜系统疾病的发病机理有极其重要的参考价值。
本实验中发现光损伤后视网膜神经递质类游离氨基酸含量升高，其余的氨基酸如苏氨酸，丝氨酸等15种被检测的视网膜游离氨基酸含量也有不同程度的升高。同时发现在急性的光损伤下，血清中的游离氨基酸含量未见明显升高，各组间比较未见显著性差异。叶黄颗粒可以降低光损伤后视网膜神经递质类游离氨基酸水平，高剂量组更明显。叶黄颗粒中叶黄素和玉米黄质在结构上互为同分异构体，分子结构中的含有40个碳原子的长链，其中有多个共轭双键，使其具有较强的还原性和清除自由基的能力，具有较强的抗氧化作用。Bone等的研究表明，人体内的视网膜和脉络膜等处还存在一种玉米黄质的同分异构体称为内消旋玉米黄质(meso－zeaxanthin)，而其淬灭单线态氧的能力比叶黄素要强。可能是叶黄素和玉米黄质抑制电压依赖性通道，减少Ca2+大量内流，清除大量氧自由基，抑制兴奋性毒性瀑布效应，保护视网膜神经组织。
本研究结果显示叶黄颗粒可以有效抑制光损伤后视网膜游离氨基酸水平的增高，改善视网膜神经组织细胞的生物循环与代谢。其机制可能是通过减少氨基酸的释放，促进其再摄取，并对抗其受体激活，或通过离子、渗透压和电化学的改变保护视网膜细胞，抑制凋亡的途径降低氨基酸的释放。
