Liu等[23]利用杆状病毒表达系统表达H5N1亚型AIV的HA蛋白，加入弗氏完全佐剂制成疫苗后免疫SPF鸡、商业用鸡和BALB/c小鼠，结果发现，该疫苗可诱导产生抗体反应且对SPF鸡和商业用鸡提供完全保护，以2μg的剂量免疫7日龄鸡两周后可产生保护性免疫，血清抗体可持续6个月，而免疫BALB/c小鼠后同样可抵抗AIV的致死性攻击，说明该疫苗具有成为控制禽类和哺乳动物流感候选 疫 苗 的 潜 力。
Kodihalli等[24]研 制 的 火 鸡H5N2亚型AIV HA和NP复合亚单位疫苗免疫火鸡21d后可产生较高的抗体滴度，并且可检测到T细胞增殖和迟发型过敏反应，说明该疫苗可诱导体液和细胞免疫应答，而随后的攻毒试验结果表明，该疫苗可以对同源和异源（H6N1）亚型AIV的攻击提供保护。李贺等[25]利用杆状病毒表 达系统获 得H7N1亚型AIV HA蛋白后，加入弗氏完全佐剂制成疫苗，以20μg/羽的剂量免疫SPF鸡，两周后进行加强免疫，加强免疫两周后的攻毒试验结果表明该疫苗对同源AIV攻击的保护率为100%,攻毒后取咽拭子和泄殖腔拭子并未分离到病毒。张新涛等[26]将H5N1亚型AIV的M2e蛋白制成疫苗后免疫SPF鸡和BALB/c小鼠，攻毒后虽可对AIV的攻击提供一定的保护，但保护率较低，可能是因为与HA相比，M2e的免疫原性较低。
传统的亚单位疫苗通过分离免疫原性强的蛋白亚单位制备而成，该方法操作复杂且成本较高，制约了亚单位疫苗的大规模生产[27].随着基因工程和分子克隆技术的发展，可将抗原基因连接到载体质粒，随后借助于各种表达系统可获得大量具有免疫原性的蛋白亚单位，从而实现基因工程亚单位疫苗的大规模生产。但由于大多亚单位疫苗提取的是单一的抗原蛋白，诱导的免疫反应强度还有待提高，这是今后的禽流感亚单位疫苗研究需要解决的问题。
3 DNA疫苗
DNA疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗，是依靠现代分子生物学技术发展而产生的一种新型疫苗。
20多年前，科学家证实，直接注射可编码免疫相关基因的真核表 达质粒即可 诱导 机 体 产 生 免 疫 应答[28].其原理是利用基因工程的方法将病毒的保护性抗原基因整合至真核表达质粒，在靶细胞中，抗原基因得以表达，从而刺激机体产生特异性的体液和细胞免疫反应[29].相比于传统疫苗，DNA疫苗具有多个优点：①DNA疫苗更加安全、稳定，且生产成本低、易于操作；②可同时诱导产生体液免疫和细胞免疫，且抗体持续时间长；③DNA疫苗具有热稳定性，易于保存和运输；④将携带不同抗原基因的真核表达质粒混合可制成广谱疫苗，抵抗多种病毒的感染；⑤DNA疫苗免疫只表达一种或几种抗原蛋白，接种时没有潜在的感染风险[30-31].
张强哲等[32]构建了可表达H5亚型AIV HA基因的重组表达质粒pC4H5和pCMVH5,采用电击法免疫小鼠和SPF鸡后，均能对H5亚型AIV的攻击提供完全保护。有研究认为，流感病毒HA、NA、M1、NP和NS1等基因均可用于DNA疫苗的生产[33],但多数采用HA基因。基于M2e基因的DNA疫苗诱导的免疫保护力虽然低于基于HA基因的DNA疫苗，但M2e基因具有在A型流感病毒中高度保守的序列，因此M2eDNA疫苗有可能在广谱 疫 苗 的 研 发 中 发 挥 重 要 作 用。 据 此，Park等[34]构建了携带H1N1亚型AIV HA和M2e基因的融合质粒，免疫动物后用H5N2亚型AIV进行攻毒试验。结果发现，融合质粒可对H5N2亚型AIV的攻击提供完全保护，且保护效果要高于只含有HA或M2e基因的质粒，表明用融合质粒构建的疫苗具有交叉保护性。
尽管与传统疫苗相比DNA疫苗具备诸多优点，但曾经有报道指出，肌肉注射免疫DNA疫苗在攻毒前并不能诱导产生可检测到的HI抗体[35],而在Chen等[36]的研究中却得到了不一样的结果。其将一株H5N1亚型AIV的HA基因克隆至载体pCI上 构 建 了 疫 苗 质 粒pCIHA,分 别 以100和50μg/羽的剂量肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡，一免两周后进行加强免疫，加强免疫两周后以10LD50进行攻毒试验。结果显示，一免两周后的HI抗体滴度分别为25.8±2.0和24.7±2.5,加强免疫两周后的HI抗体滴度分别为28.4±2.7和27.6±3.9,攻毒一周后HI抗体滴度分别为29.6±2.2和29.0±2.4,且攻毒后鸡不死亡、不排毒、无临床症状，表明DNA疫苗可引起高水平的HI抗体反应并诱导对致死性AIV攻击的完全保护。
4病毒样颗粒疫苗
流感病毒血清型众多，根据HA和NA抗原性上的差异，A型流感病毒又可进一步分为18个HA亚型和11个NA亚型，这给禽流感疫苗的研发带来了巨大的困难，病毒样颗粒（VLP）疫苗为这一难题提供了解决办法。
VLP是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的颗粒，具有完整病毒的免疫原性而不含病毒核酸，因此可诱导产生免疫应答但不能自主复制。VLP疫苗具有诸多优势：①VLP疫苗不含病毒核酸，在使用过程中不会发生病毒的基因重组，因此具有很高的安全性；②VLP可被抗原递呈细胞捕获，因此可诱导机体的细胞免疫；③VLP疫苗成本低，生产周期短，给疫苗的大规模生产提供便利；④VLP可应用多种表达系统生产，如杆状病毒表达系统、大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和哺乳动物表达系统，摆脱了传统疫苗对鸡胚的依赖，保证了禽流感大流行时疫苗的供应；⑤VLP疫苗更加稳定，不易失活[37].上述优势使VLP疫苗成为近几年研究的热点。
在上述VLP表达系统中，应用最广的是杆状病毒表达系统。杆状病毒表达系统在表达外源蛋白方面具有明显优势，易于筛选，蛋白表达水平高，成本低，易于外源蛋白的大规模生产且具有很高的安全性，更重要的是，使用该系统表达的蛋白保持了原有的生物活性，保留了原有的免疫活性[38].王立强等[39]构建了能共表达H5N1亚型AIV HA、NA、M1和M2蛋白的杆状病毒，并在昆虫细胞中组装成病毒样颗粒，该VLP的形态与AIV一致且具有血凝活性。黄晓媛等[40]对H5N1亚型禽流感VLP与全病毒灭活苗进行了体液免疫和细胞免疫的比较，免疫小鼠后发现，VLP和全病毒灭活苗均能使小鼠血 清IgG效 价 升 高 且VLP免 疫 剂 量 达 到200ng/只后可对病毒攻击提供完全保护，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例较正常小鼠均升高且与免疫剂量呈正相关，表明H5N1亚型AIV VLP可诱导机体的体液免疫和细胞免疫。
Novavax公司于2005年利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统研制成含 有H9N2亚 型AIV HA、NA、M1蛋 白 的VLPs疫苗，经对比试验表明该疫苗具有很好的免疫原 性 和 保 护 力，可 作 为 流 感 大 流 行 时 的 备 选疫苗[41].
5结语
进入21世纪以来，全球范围内暴发了多起禽流感疫情，对养殖业造成了极大的影响。不仅如此，AIV跨 越 种 间 障 碍 感 染 人 的 事 件 也 越 来 越 多。2013年暴发于中国的H7N9亚型禽流感在短时间内造成了132人感染、37人死亡的严重后果。由此可见，防控禽流感不仅关系到养殖业的健康发展，更是与人类的生命安全息息相关。研制快速而有效的禽流感疫苗一直都是人们关注的焦点，而除了疫苗本身以外，制作疫苗过程中使用的佐剂、疫苗的接种途径及其他可能影响免疫效果的因素同样值得关注，只有达到最佳的组合才能获得最好的免疫效果，这样，在面对禽流感疫情时才能更加从容。
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