1.2.6 组织中 CD4 蛋白表达水平的免疫组化检测
石蜡切片脱蜡至水，0.03% H2O2孵育10 min以封闭内源性过氧化物酶，然后按免疫组织化学SABC 法操作步骤进行染色。一抗小鼠 Anti-CD4（MCA834GA, AbD Serotec） 按 1∶50 稀释，4 ℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育10~15 min,SABC复合物室温孵育10 min （Solarbio）。以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS, pH 7.3 洗 3 次，每次 3 min.AEC显色10~30 min,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Olympus-71型光学显微镜观察，拍照。
空白对照用BSA取代一抗进行孵育，其余操作条件、步骤均相同。
1.2.7 统计学处理
采用SPSS 21.0软件对各实验组数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），相对表达水平用X± SE （n=3）表示，P<0.05为差异显着，P<0.01为差异极显着，P>0.05为差异不显着。
2 结果与分析
2.1 组织中CD4基因的RT-PCR及qRT-PCR检测
分别提取牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结组织总RNA.测序引物扩增得到包含CD4开放阅读框（ORF）序列的PCR产物长度为1 610 bp,提交至GenBank（KP030826），CD4荧光定量引物扩增产物长度为220 bp、内参β-actin荧光定量引物扩增产物长度为207 bp（图1）。使用DNAman软件分析可知牦牛CD4 mRNA的编码区范围为4~1 191 bp,全长1 188 bp,编码396个氨基酸。通过NCBI线软件分析发现牦牛CD4 mRNA与黄牛（Bos taurus）同源性为99%,绵羊（Ovis aries）、山羊（Capra hircus）同源性均为 93%,白鲸（Delphinapterus leucas）、海豚（Tursiops truncatus）的同源性约为80%,猫（Felis catus）同源性约为68%,狼（Canis lupus）同源性为67%,人类（Homo sapiens） 的同源性约为 66%,小鼠（Mus musculus）同源性为53%（图2）。
实时定量PCR结果显示，CD4 mRNA在牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结均有表达，在胸腺表达量最高，肠系膜淋巴结、血结次之，脾表达量最低，仅为胸腺表达量的1/22（P<0.01）（图3）
2.2 Western blot结果
分别提取牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结总蛋白，调整各组蛋白浓度后进行Western blot实验。
结果表明，CD4蛋白在牦牛各淋巴组织均有表达，且在胸腺表达量最高，肠系膜淋巴结、血结次之，脾表达量最低，为胸腺表达量的1/11（P<0.01）（图4）。
2.3 组织结构观察及免疫组织化学结果
在胸腺，CD4+细胞在皮质、髓质都有分布（图5A）；在脾，CD4+细胞主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓，脾小结周边及内部也有部分阳性细胞（图5B）；肠系膜淋巴结内，CD4+细胞主要分布在淋巴小结周边及髓质，淋巴小结内部少量分布（图5C）；血结内分布情况与肠系膜淋巴结类似，CD4+细胞主要分布在淋巴小结周边及髓质，淋巴小结内部少量分布（图5D）。
3 讨论
本研究表明，牦牛CD4的氨基酸序列与家牛、绵羊、山羊、白鲸、海豚、猫、狼、人和小鼠的同源性分别达到99%、93%、93%、80%、80%、68%、67%、66%及 53%,得出牦牛 CD4 的氨基酸序列与家牛同源性高达 99 %,说明该蛋白在同属种动物中具有极高的保守性。
CD4 分子主要包括两个功能：第一，作为粘附和共受体分子，增强 CD4+Th 细胞与抗原递呈细胞表面 MHCⅡ类分子结合的稳定性；第二，作为一种信号传递分子，促进 T 细胞的活化（Parnes, 1989;Killeen et al., 1993）。在本研究中，分别采取成年牦牛的胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结等淋巴器官，提取总RNA及蛋白后，应用RT-PCR 技术及WB技术对CD4 mRNA及蛋白在这些淋巴器官的表达进行定量分析。Zhang等（2012）学者研究显示，CD4分子在各淋巴器官的表达差异不显着。与此不同，本研究的结果显示，CD4分子在淋巴器官的数量有差异，其在胸腺表达量最高，肠系膜淋巴结、血结次之，脾表达量最低。这可能由于，胸腺是负责T淋巴细胞分化和成熟的中枢免疫器官，CD4-CD8-原始T细胞从骨髓或肝脏进入胸腺皮质，进行阴性和阳性选择，之后转化为CD4+CD8+表型，最后约5%T 细胞经过受体重排，转化为成熟 CD4+或CD8+T细胞，向血液及其他淋巴组织（如淋巴结、脾及黏膜相关淋巴组织）迁移（Halkias et al., 2014）。因此，胸腺内 CD4+细胞包括：成熟的CD4+单阳性T细胞及未成熟的CD4+CD8+双阳性T 细胞，使胸腺 CD4 表达量较高，这与 Bensaid和Hadam（1991）研究结果类似，60%~70% 的胸腺细胞表达CD4.然而次级淋巴器官CD4+T 细胞主要为 Th,数量可能受以下两个因素影响：胸腺输出量及淋巴细胞运输量（Bortnick et al., 1999）。值得一提的是，血结内 CD4表达量与肠系膜淋巴结接近，但二者均显着高于脾。另外，Zhang等（2012）学者研究表明，CD8+T 细胞在血结和脾的数量显着高于肠系膜淋巴结，MHCⅡ+细胞数量在血节和肠系膜淋巴结均高于脾。这提示，血结可能与肠系膜淋巴结和脾一样，在细胞免疫方面发挥重要作用。
免疫组化检测结果表明，在胸腺CD4+细胞在皮质、髓质都有分布，这与Duncan等（2012）及Ben-said 等（1991）学者研究结果一致。另外，在次级淋巴器官，CD4+细胞主要分布在脾动脉周围淋巴鞘和红髓髓索、肠系膜淋巴结内淋巴小结周边和淋巴索及血结内淋巴小结周边及髓索，此外，少量阳性细胞在B细胞依赖区生发中心也有表达。这与其他学者对不同动物 CD4 在次级淋巴器官分布的研究 结 果 相 似 （Bensaid et al., 1991; Thorp et al.,1991; Jeklova et al., 2007; Duncan et al., 2012;Zhang et al., 2012），即阳性细胞主要分布在 T 细胞依赖区：动脉周围淋巴鞘及红髓、淋巴结小结周边及淋巴索，推测这些位置可能是抗原捕获发生的主要部位，即许多抗原呈递细胞如巨噬细胞和树突状细胞分布于髓索吞噬来自淋巴和血管的外部抗原。另外，Ansel 等 （1999）报道，迁移至周边淋巴器官淋巴滤泡的CD4+T 细胞，其细胞趋化因子受体5 （chemokine receptor 5, CXCR5） 表达上调。这类辅助滤泡B细胞的 辅助性T （Th）细胞，能够通过表达CXCR5,归巢至周边淋巴器官的滤泡，辅助B淋巴细胞能够发生亲和力成熟、抗体类别转换及体细胞高频突变（Schaerli et al., 2000; Ma et al., 2014）。
4 结论
本研究显示，CD4 mRNA及蛋白在各淋巴器官中均有表达，且在胸腺表达量最高，肠系膜淋巴结、血结次之，脾表达量最低 （P<0.01）。免疫组织化学结果显示，CD4+T 细胞在胸腺皮质、髓质均有分布；在脾主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓髓索；在肠系膜淋巴结及血结内，则主要分布在淋巴小结周边及髓索。以上结果提示，牦牛胸腺为CD4+T 细胞主要的输出器官，其输出量可能影响次级淋巴器官内T细胞含量；血结可能与淋巴结及脾一样，在细胞免疫发挥同等重要的作用。这些数据将为牦牛免疫遗传学和免疫生物学等相关研究提供基础资料。
