摘要：山羊传染性胸膜肺炎 (contagious caprine pleuropneumonia, CCPP) 是由山羊支原体山羊肺炎亚种 (Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, MCCP) 引起的山羊急性或慢性呼吸道传染病, 其病原MCCP的分离培养困难, 同丝状支原体簇其他成员之间具有相似的生化和血清学性质, 因此用传统的病原学和血清学方法无法对其进行准确鉴定。而基于PCR的分子检测技术, 凭借其特异性高和敏感性强等诸多优点已被广泛应用于疾病的早期临床诊断。本文综述了CCPP的分子诊断方法, 以期为该病的防治提供技术参考。
关键词：山羊传染性胸膜肺炎; 山羊支原体山羊肺炎亚种; 病原; 分子诊断方法;
Abstract：Contagious caprine pleuropneumonia ( CCPP) in goats is caused by mycoplasma capricolum subsp. Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae ( MCCP) is an acute or chronic respiratory infectious disease whose pathogens are difficult to isolate and culture. Similarity to the biochemical and serum properties of the other members of the filiform mycoplasma family makes it impractical to precisely identify the pathogen. However, PCR-based molecular detection technology, with its advantages of high specificity, sensitivity, and so on, has been widely applied to early clinical diagnosis of diseases. This paper summarizes the existing diagnostic techniques for CCPP, providing technical references for prevention and treatment of this disease.
Keyword：contagious caprine pleuropneumonia; Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae; pathogen; molecular diagnosis;
山羊传染性胸膜肺炎 (contagious caprine pleuropneumonia, CCPP) 是由山羊支原体山羊肺炎亚种 (Mycoplasma capricolum subsp.capripneumonia, Mccp) 引起的一种接触性传染病, 其死亡率和发病率高达60%和90%, 被世界动物卫生组织 (OIE) 列为法定报告的疫病之一[1]。早在1873年, 国外就有关于CCPP的记载, 但对其病原的认识一直比较模糊[2]。直到100多年后的1976年, Mc Owan等[3]分离到1株病原体Mccp, 并证明了其致病性。国内在分离到Mccp之前, 有学者从患CCPP的山羊肺脏中分离出丝状支原体山羊亚种 (M.mycoides subsp.capri., Mmc) 和绵羊肺炎支原体 (M.ovipneumoniae, MO) [4]。此后一直认为二者是CCPP的主要病原[5-6]。造成这种对病原认识不清的主要原因是由于Mccp的分离培养比较困难、对培养基的营养要求十分苛刻, 加上病料中其他支原体如绵羊肺炎支原体 (MO) 生长迅速, 掩盖了Mccp的生长[7]。2007年, 辛九庆等[8]从山羊肺炎病料中成功分离出1株支原体, 利用分子生物学方法对其进行了基因特征比较, 证明分离到的支原体为Mccp, 这是国内首次报道从临床病例中分离到Mccp。李媛等[9]利用PCR技术、限制性酶切和序列分析等手段对中国早期分离的4株CCPP病原进行分子特征研究, 首次提出其与Mccp亲缘关系最近, 并将国内流行的CCPP病原定为Mccp。2011年, 郭晗[10]从甘肃患CCPP的山羊体内分离到1株纯培养物M1601, 通过分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定和人工感染试验, 证明其属于Mccp。然后根据16S rRNA基因和5个看家基因进行分子进化分析, 进一步从分子水平证明M1601株为Mccp, 从而获得了Mccp甘肃分离株M1601。这些结果证明了CCPP在我国流行, 危害我国养羊业生产。
在临床病理学上, CCPP很难与小反刍兽疫病毒 (peste des petits ruminants virus) 和多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella multocida) 等引起的山羊呼吸道症状区分开[11]。此外, 由丝状支原体 (M.mycoides) 和山羊支原体山羊亚种 (M.capricolum subsp.caprcolum) 引起的乳腺炎、关节炎、角膜炎、肺炎和败血症 (MAKe PS) 与CCPP具有相似的临床症状[11-12]。因此, CCPP的诊断极为复杂, 除病原学和血清学诊断以外, 还需结合其他方法进行确诊。分子生物学的发展, 尤其是近年来发展起来的各种PCR方法, 为病原的快速诊断提供了理论依据和技术支持。
用分子生物学方法鉴定CCPP病原, 最初是用Cap-21基因探针杂交从丝状支原体簇成员中鉴别出Mccp/Mcc, 然后用F38-12基因探针从Mccp/Mcc中鉴定Mccp[13]。由于该方法操作步骤复杂, 已被各种更加方便快捷的PCR诊断技术所代替。现将主要的6种方法进行具体介绍。
1、聚合酶链式反应 (polymerase chain reac-tion, PCR)
PCR技术的发展在很大程度上促进了兽医工作者对各种流行病病原的认识, 该技术可以从混合培养物、或者直接从临床病料组织如胸腔积液、肺脏以及带有这些组织的干燥滤纸片上快速检出支原体。Woubit等[12]以Mccp arc D基因为靶标序列, 设计特异性引物Mccp-spec-F/R (扩增片段大小为318bp) , 以Mccp不同菌株、其他丝状支原体簇成员以及腐败支原体的基因组DNA为模板进行PCR扩增, 结果只有在Mccp各菌株中扩增出目的片段, 证明该方法可以特异性鉴定Mccp。2009年, 储岳峰等[14]采用PCR技术从患病山羊肺组织和胸水中直接检出Mccp, 从病原学上证实CCPP在我国流行。
由于多杀性巴氏杆菌、小反刍兽医病毒等也可引起类似CCPP的临床症状, 且容易与Mccp混合感染, 因此, 为了快速而准确地诊断CCPP病原, 亢宁宁等[15]采用Mccp和多杀性巴氏杆菌特异性引物, 建立了一种能同时检测Mccp和多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法, 检测结果具有特异性好、敏感性高等特点。鉴于临床上能引起类似CCPP疾病病原的复杂性, 根据各病原特异性基因序列设计不同引物对, 建立可以同时检测多种病原的多重PCR方法, 将是快速、准确诊断CCPP病原的趋势。
2、聚合酶链式反应-限制性酶切分析 (polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis, PCR-REA)
丝状支原体簇所有成员均含2个rRNA操纵子, 在2个操纵子的16S rRNA基因上存在序列变异[16], B9lske等[17]通过对丝状支原体簇成员16S rRNA基因的2个操纵子序列进行比对分析发现, Mccp的2个操纵子之间部分序列的变异会导致酶切位点发生变化, 并根据该位点变异建立了一种用来鉴定Mccp的PCR-REA方法, PCR产物经限制性内切酶PstⅠ消化后, Mccp可产生特异性的限制性酶切带型, 由此可以将Mccp与其他丝状支原体簇成员加以区分。
3、实时荧光定量PCR (real-time fluore-scence quantitative PCR, q PCR)
与传统PCR方法相比, q PCR对病原检测的特异性和敏感性明显提高, 同时对实验室和实验人员的要求更加严格, 目前该方法主要用于专业实验室对疾病的诊断工作。2004年, Woubit等[12]根据丝状支原体簇成员的arc D基因序列差异建立了一种特异性鉴定Mccp的PCR方法。在该PCR方法的基础上, Lorrenzon等[18]建立了一种用于检测Mccp的q PCR方法, 结果表明, 所建立的q方法 (SYBR green法) 在同样的样品条件下, 较普通PCR的敏感性和特异性更强。但众所周知, 与SYBR green法相比, Taq Man探针法的特异性和敏感性更高, 但截至目前, 国内外还没有关于Taq Man探针q PCR检测Mccp的报道。因此, 本实验室正在建立一种用于快速诊断CCPP病原的Taq Man探针q PCR方法。
4、环介导等温扩增 (loop-mediated isother-mal amplification, LAMP)
LAMP是2000年日本学者Notomi等[19]建立的一种核酸等温扩增技术, 与普通PCR相比, 具有简单、快速、敏感、特异和不需要特殊仪器设备等特点。目前, LAMP技术已广泛用于疾病诊断、病原微生物检测和转基因食品的鉴定[20-22]。谢秀兰等[23]以丝状支原体簇16S rRNA基因为靶序列, 设计4条特异性引物, 建立了快速检测丝状支原体簇的LAMP方法, 结果发现该方法可以对丝状支原体簇各成员进行LAMP扩增, 而对绵羊肺炎支原体及羊的其他病原体不发生反应, 对丝状支原体山羊亚种PG3检测的最低限为10 pg/μL, 说明所建立的LAMP方法特异性强、敏感性高。为了从丝状支原体簇中快速检测出Mccp, He等[24]以Mccp H2基因序列为模板设计4条特异性引物, 建立了检测Mccp的LAMP方法, 结果发现Mccp与丝状支原体簇其他菌株无交叉反应, 且每个反应能检测出约0.75 fg的Mccp基因组DNA, 而普通PCR只能检出750 pg的Mccp基因组DNA。由此表明所建立的方法特异性和敏感性较好, 可用于CCPP流行病学的诊断和调查。
5、恒温隔绝式PCR (insulated isothermal PCR, ii PCR)
2002年, Krishnan等[25]发明了以POCKITTM核酸分析仪 (POCKITTMNucleic Acid Analyzer) 为操作仪器的核酸等温扩增技术, ii PCR。它实现了用分子生物学方法检测病原的快速化和便捷化。其原理是将R-tubeTM放入POCKITTM核酸分析仪内, 通过底部加热可使R-tubeTM内的反应液自发形成对流运动, 即底部温度高的液体因密度小而上浮, 上部温度低的液体因密度大而下沉, 如此循环往复, 以实现普通PCR的变性、退火和延伸等步骤。此外, 该方法还引入了荧光水解探针技术, 通过集成在仪器中的数据处理模块, 在42 min内自动产生荧光信号, 并将其转换成阳性 (+) 或阴性 (-) 判读结果。其中, 四通道POCKITTM核酸分析仪 (POCKITTMmicro plus, GeneReach, Taichung, Taiwan) 具有小巧轻盈 (自重只有380 g) 、操作简单、反应时间短 (整个ii PCR反应在42 min内便可完成) 、便于携带、自带电源 (充电1次可用6 h) 、无需设置反应条件和无需琼脂糖凝胶电泳检测等优点, 实现了病原检测的现场化和程序化, 特别适用于疫病现场病原的快速诊断。
该技术自2002年在Science杂志上报道以来, 已用于猪瘟病毒[26]、猪流行性腹泻病毒[27]、犬瘟热病毒[28]、犬细小病毒[29]、马流感病毒[30]、马孢疹病毒[31]和牛轮状病毒[32]等病原的快速检测, 同时也用于食品中沙门菌[33]的检测。截至目前, 国内外还没有用ii PCR方法检测CCPP病原的报道。本实验室前期利用arc D基因作为靶基因, 设计了1套引物和探针, 通过优化反应条件, 已初步建立了检测CCPP病原的ii PCR方法, 有望适用于临床现场的快速检测。
6、重组酶聚合酶扩增 (recombinase polymer-ase amplification, RPA)
近年来, 核酸等温扩增技术得到了快速发展, 这些技术弥补了传统PCR技术的不足, 可在短时间内快速扩增出目的片段, 从而达到快速检测和诊断病原的目的[34]。2006年, Piepenburg等[35]建立了一种新型核酸等温扩增技术, RPA。它主要依赖于3种酶:能与寡核苷酸引物结合的重组酶 (recombinase) 、单链DNA结合蛋白 (SSB) 和链置换DNA聚合酶 (polymerase) , 这3种酶的混合物在常温下也有活性, 最佳反应温度在37℃左右。重组酶与寡核苷酸引物结合形成的“重组酶-引物”复合体能在双链DNA模板上寻找与引物对应的互补序列, 一旦引物定位到靶标序列, 双链DNA分子会在重组酶的作用下解链, 然后SSB与每条单链DNA迅速结合, 同时在引物和DNA聚合酶的作用下形成2条完整的DNA双链, 作为下一次反应的模板, 进行指数式扩增。整个RPA反应过程进行的非常快, 其扩增产物的检测方法有3种, 琼脂糖凝胶电泳检测、试纸条检测和荧光探针检测。
6.1、琼脂糖凝胶电泳检测
RPA扩增可以在PCR仪或水浴锅中进行, 一般在37℃20 min内即可完成扩增反应, 扩增产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳检测。
6.2、试纸条检测
该方法结合了免疫技术、分子杂交技术、胶体金标记技术和侧向流层析技术, 其原理为生物素标记的核酸扩增产物可以和FAM标记的特异性探针进行杂交, 然后与试纸条上Anti-FAM/DIG抗体的金标物结合, 免疫复合物通过层析膜扩散到检测线时, 生物素标记的扩增产物被配体捕获, 形成具有颜色的检测线 (detection line) , 不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线 (control line) 被特异性抗体捕获, 形成具有颜色的质控线。该方法特异性好、检测时间短、2~10 min就能观察到检测结果。Yin等[36]采用侧向流试纸条RPA (LF-RPA) 方法对疫区环形泰勒虫病 (T.annulata) 进行快速诊断, 发现该方法可快速 (常温下5 min内可检测到结果) 、敏感 (基因组DNA最低检测限为2 pg) 、特异 (与牛犁浆虫无交叉反应) 检测泰勒虫病。
6.3、荧光探针检测
在RPA反应体系中加入1个荧光标记的探针可对扩增产物实时检测, 使用便携式的荧光检测仪可在10~20 min内检测到荧光曲线, 该方法已应用于病原微生物的检测[37-38]。Liljnder等[39]以分离自肯尼亚疫区Mccp ILRI181菌株的全基因组序列为靶标序列设计RPA引物和探针, 建立了一种快速、敏感和特异性检测Mccp的RPA方法, 他们利用该方法直接从患病山羊的临床样本 (包括胸腔积液和肺脏组织) 中快速诊断CCPP。结果发现, 该方法可以通过荧光信号的产生从CCPP阳性感染动物的胸腔积液中直接检出Mccp。
7、小结
笔者通过对上述6种方法进行可行性比较发现, 普通PCR技术具有操作简单、成本低廉等优点, 但是该方法容易出现交叉污染而影响检测结果的准确性。PCR-REA方法虽然在一定程度上弥补了普通PCR的不足, 但在后反应过程中还需进行限制性酶切分析, 步骤复杂, 不宜用于病原的快速诊断。q PCR技术虽然在特异性和敏感性方面远远超过普通PCR方法, 但试剂价格昂贵、仪器设备成本较高、需要专业的试验人员进行操作, 因此该方法仅用于专业实验室对病原的诊断和定量工作, 目前还无法推广到疫病现场和资源稀缺的地区。LAMP技术具有较普通PCR更高的敏感性、特异性以及操作简便等优点, 但该技术需要4条特异性引物, 且引物设计复杂, 反应温度通常在60℃左右, 其扩增产物需要进行分离纯化和琼脂糖凝胶电泳检测等步骤, 限制了该方法在田间推广应用。近年来, 随着核酸等温扩增技术的发展, ii PCR和RPA技术凭借其操作简便、反应时间短 (可在1 h内获取检测结果) 和可对疫病进行现场诊断等优点, 在病原的诊断和疫病检测方面颇受广大科研人员和基层兽医工作者的青睐。但就目前来看, 2种方法所需试剂价格昂贵, 因此开发出成本低廉的诊断试剂盒将是上述2种方法加以大规模推广应用的有力保证。
总之, 在今后病原的诊断工作中, 应根据实验室条件选择适宜的检测方法, 或一种或多种方法结合使用, 这样更能增加检测结果的准确性和可靠度。当然, 对于基层兽医站或养殖场而言, 适合于临床快速检测的ii PCR和RPA技术可成为其首选方法。
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