膀胱功能障碍是临床上常见的泌尿外科疾病。逼尿肌兴奋性异常可导致膀胱过度活动、糖尿病性膀胱等多种膀胱疾病的发生。目前，导致膀胱收缩功能障碍的病因还存在较大争议，肌源性和神经源性因素都有可能参与膀胱兴奋性的调节，而肌源性因素日益受到重视。
越 来 越 多 的 证 据 显 示 Cajal 间 质 细 胞（interstitial cells of Cajal,ICCs）对调节膀胱的兴奋性具有重要的作用.BK 通道由孔道形成亚基 α 与调节亚基 β1~4 组成，能够被细胞膜去极化和钙离子内流激活，并能够被蝎毒素 iberiotoxin（IBTX）高选择性阻滞.
细胞内肌浆网雷诺定受体钙离子释放（钙火花）也可激活 BK 通道。BK 通道开放可使膀胱平滑肌细胞动作电位复极化并保持电位的稳定,近期研究证明，BK 通道可以通过反馈性抑制平滑肌细胞的兴奋来调节膀胱收缩功能.BK 通道的下调或上调将导致膀胱过度活动或膀胱收缩功能障碍等疾病。其中 β1 亚基主要在平滑肌和肾脏表达,对增加通道的钙敏感性，减弱电流激活动力学起关键作用.然而，BK 通道如何参与调节膀胱 ICCs 细胞膜电位和兴奋性尚少见详细的报道。
本研究初步探讨了 BK 通道在膀胱 ICCS 细胞中的表达和潜在调控功能，以期对膀胱功能异常的基础研究提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 动物准备
2 月龄健康雌性清洁 SD 大鼠 48 只，体质量 180~220 g,购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，戊巴比妥钠（4 mg/100g）行腹腔注射麻醉，行静脉注射过量戊巴比妥钠将动物处死。
1.2 Western blot 法检测膀胱 ICCs 细胞 BK 通道表达
3 只大鼠过量麻醉处死，各取膀胱组织 100 mg,PBS 快速冲洗后，加入 200 μL 含有 1 mmol/L PMSF 的 RIPA 裂解液（碧云天公司），充分剪碎后玻璃匀浆器匀浆，冰上裂解 30min,离心后取上清按 4:1 加入 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（碧云天公司）煮沸，BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司）标定蛋白浓度。-80℃分装保存。使用 SDS-PAGE 电泳分离蛋白样品，80 V 恒压浓缩 40 min 后，120 V 恒压分离 90 min.
按照蛋白 Maker 标定位置切下目的蛋白所在位置凝胶，250 mA恒流 60 min 将蛋白转至 0.22 μm PVDF 膜上。5% BSA 摇床室温封闭 2 h,3 个兔多克隆抗体（均购自 Abcam 公司）anti-KCNMα（1:600）、anti-KCNMβ1（1:800）、anti-GAPDH（1:1 000）4 ℃过夜孵育。TBST 洗膜后，二抗山羊抗兔（1:1500,中杉金桥公司）室温孵育 2 h,ECL 化学发光液（Millipore公司，）显影条带，Image lab 软件处理结果。
1.3 免疫荧光双标观察膀胱 ICCS 细胞 BK 通道表达
将大鼠同 1.2 中方法处死，取出膀胱组织，放入 4%多聚甲醛中常温下固定 6~8 h,在显微镜下将黏膜小心撕掉，留下肌肉层并做成撕片，1% BSA 孵育 1 h 阻断非特异性结合，然后 0.3% Triton X-100 孵育 10~15 min,PBS 漂洗 10 min×3 次。然后孵育一抗，一抗为小鼠 anti-kit（ICCS 细胞特异性标记物）（Santa Cruz Biotechnology）；小鼠多克隆anti-KCNMα（1:200），兔多克隆 anti-KCNMβ1（1:200）（Abcam）。4 ℃孵育 24 h 后避光孵育分别结合了 FITC 和 CY3的二抗（1:150），37℃孵育 1 h.随后孵育 DAPI（Sigma 公司）15 min 染细胞核。再次将组织撕片漂洗 10min×3 次后，将撕片平铺在载玻片上用 Leica TCS-SP5 激光共聚焦显微镜（Leica, Mannheim）进行观察。采用孵育血清代替 anti-KCNMα和 anti-KCNMβ1 的组织作为阴性对照，大鼠胃组织样本作为阳性对照。
1.4 膀胱 ICCS 细胞原代分离
将大鼠膀胱剪成 1mm3碎块，加入配置了木瓜蛋白酶（1mg/mL）（Biosharp）、二硫苏糖醇（1 mg/mL）和 BSA（1 mg/mL）（Sigma）的 D-Hank's（Gibco）中，37 ℃ 消化 5 min;然后将组织碎块转移到配置了Ⅱ型胶原酶（1 mg/mL）（Biosharp）、二硫苏糖醇（1 mg/mL）和 BSA（1 mg/mL）的 D-Hank's 中，继续 37℃消化 40~45 min.离心去掉上清消化酶后，用移液管将组织碎块在 D-Hank's 中轻轻吹打，释放出细胞.分离出的 ICCs 细胞呈长梭型，周身有细小侧枝突起的典型外观，可与平滑肌细胞进行区别.
1.5 膜片钳记录膀胱 ICCS 细胞 BK 通道电流
利用穿孔膜片钳技术对上述两步酶消化法急性分离出的膀胱 ICCs 细胞上 BK 通道电流进行记录。细胞外液（mmol/L）：134NaCl, 6 KCl, MgCl2, 2 CaCl2,10 glucose, and 10 Hepes, pH7.4 （NaOH），电极内液：110 门冬氨酸钾 , 30 KCl, 10 NaCl, 1MgCl2, 0.05 EGTA, 200 μg/mL 两性霉素 B, 10 Hepes, pH 7.2（NaOH）。为了得到稳态 BK 外向电流，采取电压阶跃方案：钳制电压为-70 mV,然后开始从-40~+80mV 进行去极化，检测电压每步阶跃 20 mV,时程 200 ms,记录 BK 通道阻滞剂 IBTX（200nmol/L）（Sigma）加入前后 ICCs 细胞 BK 电流，实验温度 21~25 ℃。电流大小由细胞电容进行标准化，每次去极化阶跃的最后 50 ms 的平均电流值用来描绘电流-电压关系曲线图。
1.6 激光共聚焦检测膀胱 ICCS 细胞钙内流
ICCs 细胞加入含有10%胎牛血清和25 ng/mL 干细胞因子的DMEM 培养基在37℃，5% CO2/95% O2的孵箱中贴壁。然后，Hank'液漂洗2次，加入1 μmol/L fluo-4 AM （Molecular Probes）避光孵育30 min.Hank‘液再次漂洗后利用激光共聚焦显微镜观察钙影像，激发光为488 nm.运用 Leica TIRF 动态影像收集系统12帧/min 对 ICCs 细胞进行实时影像采集。加入 BK 通道阻滞剂 IBTX （200 nmol/L）分析 BK 通道对 ICCS 细胞钙内流的影响。最终数据采用相对荧光强度进行记录分析：相对荧光强度[RFI]=F1/F0,F1=加阻滞剂后的平均荧光强度，F0=加阻滞剂前的平均荧光强度。
1.7 统计学处理数据
以 x ±s 表示，采用 SPSS 16.0 统计软件，组间计量资料比较行 t 检验。
2 结果
2.1 BK 通道的蛋白表达和免疫荧光染色定位
Western blot 法检测3只 SD 大鼠的 BK 通道蛋白表达发现，具有主要功能作用的α和β1两个亚基均在 SD 大鼠膀胱组织中表达（图1），提示 BK 通道在膀胱排尿控制中可能具有功能学意义。进一步的免疫荧光染色显示大鼠逼尿肌组织中存在 c-kit染色阳性的 ICCs 细胞，该类细胞分布在平滑肌束周围，呈多边形或梭形，核大，通常带有2~3个突触（图2,绿色标记细胞）。【图1】
双标结果显示在膀胱 c-kit 阳性 ICCs 细胞上观察到 BK 通道ɑ、β1亚型染色（图2,红色标记）。阳性对照标本中亦可见 c-kit阳性细胞与β1亚型共表达，阴性对照逼尿肌组织铺片标本中c-kit 阳性细胞未见β1亚型表达（图2,蓝色标记为细胞核）。推测表明膀胱 ICC 样细胞膜上表达 BK 通道ɑ、β1亚型。【图2】
2.2 膀胱 ICCs 细胞 BK 电流
利用全细胞穿孔膜片钳技术记录大鼠膀胱 ICCs 细胞IBTX 敏感 BK 电流的特点。应用电压钳电压阶跃方案，随着逐级去极化的电压，细胞反应出逐渐增加的外向电流（图3A）。【图3】
发现 IBTX（200 nmol/L）可以抑制 ICCs 细胞大部分外向 K+电流（图3B、D），用细胞外液洗脱后，给予电压阶跃，BK 电流又恢复到了之前的情况（图3C、D）。ICCs 细胞平均电容为（41.52±8.76）pF（n=8），通过细胞电压脉冲末端电流除以细胞电容来标准化数据，以此描绘 BK 电流-电压关系（图3E），选择电压+80 mV 下药物作用2 min 时得到的相对电流与加药前进行统计发现，IBTX 能使 ICCs 细胞中的 BK 相对电流由（23.627±3.897）pA 降低为（3.603±1.885）pA,降幅明显（n=5,P<0.05）。说明 BK 通道是生理条件下影响膀胱ICCs 细胞兴奋性的主要决定因素。
2.3 膀胱 ICCs 细胞内钙荧光变化
通过激光共聚焦显微镜记录分析大鼠膀胱 ICCs 细胞内钙离子瞬变活动，评价抑制 BK 通道对膀胱 ICCs 细胞的兴奋性的影响。图4显示加入 IBTX（200 nmol/L）后，大鼠 ICCs 细胞钙荧光有所增加，细胞胞内钙荧光强度（F1/F0）从（1.00±0.07）增加到（1.84±0.45）（n=9,P<0.05）。说明 ICCs细胞胞内外钙活动可被BK通道调节，抑制BK通道可导致ICCs细胞兴奋性增高。【图4】
3 讨论
膀胱的兴奋和收缩受多种因素调节。研究数据证明在逼尿肌不稳定膀胱，ICCs 细胞数量减少,然而在功能不稳定膀胱中 ICCs 细胞数量有所增加.ICCs 细胞兴奋性的改变会导致一系列膀胱功能紊乱，ICCs 细胞上的离子通道与膀胱收缩功能密切相关,BK 通道是其重要的离子通道之一。目前，对膀胱 ICCs 细胞上离子通道的研究并不深入，尤其是 ICCs 细胞上 BK 通道的特性和对细胞的兴奋性调控作用机制研究更加缺乏。本研究发现大鼠膀胱ICCs 细胞中有 BK 通道表达，并对 ICCs 细胞中 BK 通道外向电流的特性，以及 BK 通道对膀胱 ICCS 细胞兴奋性的作用进行了分析。
膀胱 ICCs 细胞是一类与胃肠道 ICCs 起搏细胞类似的特殊间质细胞，其作用可能包括参与收缩活动的起搏，神经信号的整合及传递，以及作为感受器将各种刺激上传等,膀胱平滑肌细胞和神经元与 ICCs 细胞紧密联系，膀胱 ICCs 细胞的异常活动将引起信号网络的损坏，并导致平滑肌不协调收缩。
BK 通道同时对细胞膜电位和胞内钙水平敏感，激活后可以抑制通过钙通道内流的钙离子，从而降低细胞的兴奋性，大部分对 BK 通道的研究关注神经细胞和平滑肌细胞，目前可兴奋组织中 BK 通道的研究受到了越来越多的关注。BK 通道可调节神经兴奋、突触传导和血管肌源性收缩等多种生理过程，在如怀孕、高血压、糖尿病等病理生理状态下，BK 通道的功能都有所改变,BK 通道敲除小鼠会表现出逼尿肌不稳定.研究报道证实膀胱 ICCs 细胞中存在BK 通道,但是缺乏深入的病理生理学特性分析。
阻断 ICCs 细胞上 BK 通道能够使细胞膜电位去极化，通过缝隙连接影响平滑肌细胞或者增加 ICCs 细胞内钙离子水平激活ICCs细胞与平滑肌细胞之间的信号通路。ICCs 细胞很可能通过 BK 通道对膀胱平滑肌的兴奋收缩发挥重要的调控作用。
本研究利用免疫荧光双标证实了 BK 通道 ɑ、β1亚基在膀胱 ICCs 上的表达。需要更深入的研究探索 BK通道各亚基对调控 ICCs 细胞的具体功能。利用膜片钳技术记录到膀胱 ICCs 上 BK 电生理特性，发现类似于平滑肌细胞，IBTX 可降低 ICCs 细胞大部分 BK 电流。
BK 通道的下调是否增加 ICCs 细胞的活性。细胞钙离子内流可导致动作电位上升，ICCs 细胞可因胞内钙离子的改变而自发产生兴奋.钙动力学在 ICCs 细胞对胃肠道的起搏功能中发挥着关键作用.BK 通道的负反馈作用通过调节细胞内钙离子浓度改变细胞的兴奋性.我们发现 IBTX 可以明显增加 ICCs 细胞内钙水平，BK 通道被抑制后，细胞膜电位负反馈抑制作用下降，钙通道开放增多，导致了胞内钙增高，胞内钙水平代表了细胞兴奋性，因此我们可以总结出，BK 通道的表达下调导致了 ICCs 细胞兴奋性增高。
总得来说，大鼠膀胱 ICCs 细胞表达 BK 通道，阻断 BK 能够增加 ICCs 细胞兴奋性，这对更深入的研究BK 通道调节膀胱收缩的机制和膀胱兴奋性调控机制提供新的思路，有望对逼尿肌兴奋性异常的基础研究和临床诊治带来新的突破，丰富泌尿系统病理生理的理论基础。
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