摘 要： 目的 针对3种梅毒螺旋体血清学检验方法在临床应用进行分析。方法 患者标本首先进行梅毒螺旋体抗体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）检测，其中336例阳性患者再进行梅毒螺旋体明胶颗粒凝集实验（TPPA）、快速血浆反应素环状卡片实验（RPR）两种血清学检测。临床上明确诊断为梅毒的238例患者作为研究组，同期来我院就诊的150例健康体检者作为对照组，统计检测结果进行分析。结果 随着TP-ELISA试验的S/CO值的升高，TPELISA与TPPA检测结果的符合率随之升高。TPPA敏感度与特异度分别为97.47%、99.16%;ELISA分别为98.32%、98.00%;RPR分别为78.57%、94.00%。RPR对于早期与潜伏期梅毒的实验室检测阳性检出率明显低于TPPA、ELISA(P<0.05），而三种方法对晚期梅毒实验室检测阳性检出率未见明显差异（P>0.05）。结论 TPPA与ELISA方法检验梅毒螺旋体敏感度和特异度均较好，是良好的血清学检测方法适用于筛查和确诊，RPR适用于判断梅毒疗效及观察病情进程。TPPA或ELISA联合RPR实验可作为各期梅毒检测的可靠方法。
关键词： 梅毒螺旋体; 酶联免疫吸附法(ELISA); 明胶颗粒凝集法(TPPA); 快速血浆反应素环状卡片实验(RPR); 敏感度; 特异度;
Abstract： Objective To explore the clinical application value of three serological methods for Treponema pallidum.Methods All samples were tested by TP-ELISA titer.If TP-ELISA was positive,TPPA was used to confirm the TPELISA.Among them,336 positive patients were treated with gelatin particle agglutination(TPPA)and RPR two serological tests,238 syphilis patients in outpatient and inpatient treatment of Dermatology and Venereology Department of our hospital were taken as study group,150 non-syphilis patients in our hospital were taken as control group during the same period.All subjects were collected venous blood for three serological tests:enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),gelatin particle agglutination assay(TPPA),rapid plasma reactin assay(RPR).Results TPPA sensitivity and specificity were 97.47% and 99.16%,ELISA 98.32% and 98.00%,RPR 78.57% and 94.00%,respectively.The positive coincidence rate of ELISA and TPPA was 99.6%.The positive rate of RPR for primary,secondary and latent syphilis was significantly lower than that of TPPA and ELISA(P<0.05),but there was no significant difference among the three methods(P>0.05).Conclusion TPPA and ELISA are good serological diagnostic methods for Treponema pallidum.TRUST is suitable for judging the efficacy of syphilis and observing the course of the disease.TPPA or ELISA combined with RPR test can be used as a reliable method for syphilis screening in different stages.
Keyword： Treponema pallidum; Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA); Gelatin particle agglutination as-say(TPPA); Rapid plasma reactin assay(RPR); Sensitivity; Specificity; Positive coincidence rate;
梅毒是一种由梅毒螺旋体感染人体产生的慢性传染性疾病，主要通过粘膜接触进行传播，也可母婴垂直传播。该病临床表现较为复杂。病程分为三期，一期、二期又称为早期梅毒，传染性强破坏性小，三期梅毒又称为晚期梅毒，传染性弱但是破坏性较强，未得到及时治疗可造成人体多器官受累，多系统损害，功能失常，如心血管梅毒、骨梅毒和神经梅毒等，甚至危及生命[1]。目前，由于核酸扩增技术尚未广泛应用于临床，故血清学检测仍然是实验室检测梅毒螺旋体感染最常用的方法[2]。人体感染梅毒螺旋体后产生两种抗体[3]，一种针对梅毒螺旋体的特异性抗体，在梅毒感染约2周左右即可产生，此类血清抗体检测临床通常使用梅毒螺旋体明胶颗粒凝集实验（TPPA），酶联免疫吸附实验（ELISA）、梅毒螺旋体化学发光免疫分析（CLIA）检测；另一种为针对类脂质类物质的非特异性抗体，通常较特异性抗体出现晚2-3周，临床可选用快速血浆反应素环形卡片实验（RPR）、甲苯胺红不加热血清实验（TRUST）等方法进行检测[4]。本研究采用梅毒螺旋体抗体酶联免疫吸附实验（TP-ELISA）、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集实验（TPPA）、快速血浆反应素环形卡片实验（RPR）分别检测梅毒患者血清，评价不同血清学检验方法的检测效能，具体操作如下。
1、 资料与方法
1.1 、一般资料
搜集2019年1月-2019年3月我院门诊及住院的10273例患者标本进行梅毒抗体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA），患者就诊于不同科室，所患基础疾病不同，其中男性5169名，女性5104名，年龄分布0-97岁，阳性结果再分别进行TPPA,RPR检测，统计结果。将其中经临床诊断为梅毒的238例患者作为研究组，临床诊断及分期标准参照卫生部《中华人民共和国卫生行业标准梅毒诊断标准WS273-2018》。其中男143例，女95例，年龄19-82岁，梅毒一期106例，二期59例，三期16例；潜伏期57例。选取健康体检者150例作为对照组，其中男83例，女67例，年龄17-85岁。所有检测标本均为空腹采集的静脉血血清。
1.2、 方法
1.2.1 、仪器和试剂
主要试剂选用珠海丽珠试剂股份有限公司ELISA试剂盒、日本富士瑞必欧株式会社梅毒螺旋体诊断试剂盒（明胶颗粒凝集法）、上海科华生物技术有限公司RPR试剂盒；仪器选用爱得康ELISA600全自动酶免分析仪。
1.2.2、 检验方法
于清晨空腹状态下采静脉血3ml，离心分离血清（4 000r/min,6min）。严格按照相应说明书中的方法进行操作，首先进行TP-ELISA检测，检测结果S/CO≥1的标本，再分别进行TPPA、RPR检测，具体方法如下：（1)ELISA法：应用艾德康全自动酶免分析仪进行操作，操作过程严格按照试剂盒说明书设定程序，反应完成后通过酶标仪检测吸光度，吸光度OD>0.105即（S/CO值>1）判定为阳性。（2)TPPA法：将100μl血清稀释液加至微孔板第1孔内，其后3孔各加入25μl。用微量移液器取样品25μl至第1孔中，混匀后吸出25μl至第2孔，同样方式稀释至第4孔，在第4孔混匀后弃去25μl。稀释后第3孔、第4孔稀释倍数分别为1∶20、1∶40，使用微量加样器在第3孔中加入25μl未致敏颗粒，第4孔中加入25μl致敏颗粒，此时样本最终稀释倍数为1∶40、1∶80，混匀后室温水平放置2h后观察结果。阳性判定标准：第4孔反应产生环状分散粒子判定为阳性。（3)RPR法：血清进行倍比稀释至1∶2、1∶4、1∶8、1∶16实验卡标号1-4；依次从圈4-1将稀释后标本涂布于整个圈内；加入1滴抗原（约17μl/滴）；将实验卡置于水平旋转仪，100±2r/min旋转8分钟；取出实验卡在亮光下肉眼观察结果。若标本出现黑色块状沉淀，即判定为阳性，阳性结果应报告其稀释倍数，即为其滴度。三种方法检测完毕，结合临床表现，选取有明确诊断的标本作为研究组，与对照组进行比较，针对三种检测方法的敏感性和特异性进行比较。
1.3、 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件对本研究数据进行分析处理，计数资料采用（n，%）表示，数据比较行χ2检验，设置检验水准α=0.05，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2、 结果
2.1 、10273例患者标本进行梅毒抗体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）的一般情况
10273例患者为我院门诊及住院患者，就诊于不同科室，所患基础疾病不同，男性5169名，女性5104名，其中TP-ELISA检测阳性的患者共336例，男性171例，女性165例，阳性率约3%，年龄分布见表1。
表1 TP-ELISA阳性患者年龄分布
2.2、 336例TP-ELISA阳性，3例TP-ELISA弱阳
性共计339例患者的TPPA结果与TP-ELISA结果符合率随TP-ELISA S/CO值的升高呈现同步升高趋势，见表2。
表2 TP-ELISA TPPA检测结果的符合率
2.3、三种检测方法敏感度、特异度
分别统计238例梅毒患者与150例非梅毒患者的三种检测方法结果得知，TPPA法敏感度与特异度分别为97.47%、99.33%;ELISA法分别为98.32%、98.00%;RPR法分别为78.57%、94.00%。见表3。
2.4、三种检测方法在不同分期梅毒患者的阳性检出率
对于一期、二期与潜伏期梅毒，RPR方法检测的阳性率明显低于TPPA、ELISA法（P<0.05），而对于三期梅毒，三种方法检测的阳性率未有明显差异（P>0.05）。见表3。
表3 三种梅毒螺旋体检测方法敏感度和特异度
表4 不同分期梅毒患者的阳性检出率
3、 讨论
梅毒在我国传染病防治法中被列为乙类防治病种，近年来在我国患病率持续攀升，该病早期主要侵犯皮肤和粘膜，晚期还可侵犯心脏血管系统及中枢神经系统，造成重要器官及组织永久性损害[5]。梅毒病程较长，早期防治控制病程进展是治疗关键，目前临床上依据患者病史、血清学检测结果、临床表现进行综合诊断，故提高实验室血清学检测梅毒螺旋体的灵敏度，选择合适的检测方法，对于明确诊断、尽早治疗梅毒具有重要意义。梅毒螺旋体感染人体，可产生梅毒螺旋体非特异性（抗类脂质抗体）与特异性两种不同的抗体类型，两种抗体的检测对于梅毒患者的筛检及确认具有不同的临床意义，非特异性抗体又称为反应素，在梅毒螺旋体感染3-4周产生，伴随着有效治疗而消失，后者为特异性抗体，在感染2周左右产生，这种IgG类型抗体一旦产生，便会终身携带，不会随着有效治疗而消失。两种抗体在疾病的诊断，疗效观察，复发判断方面具有不同的意义。本研究中所选TPPA、ELISA检测方法针对特异性抗体、RPR检测方法则针对非特异性抗体进行检测，探讨了三种检测方法的符合率及临床应用价值。
本次研究对象为我院门诊及住院患者共10273例，因为ELISA方法操作简单，可作为高通量的检测项目进行自动化仪器操作，且敏感性较好，所以被作为首选的筛查方法。检测结果经过判读后，共336例判断阳性，阳性率约3%，其中由于参与检测的患者年龄不同，所患基础疾病不同，存在一定引起TP-ELISA法生物学假阳性的因素。TPPA法检测是采用梅毒螺旋体毒株作为抗原包被在凝胶颗粒上，与梅毒血清样本中的特异性抗体结合产生颗粒凝集。是目前较权威的梅毒确诊实验[6]方法，所以，我们将ELISA检测判断阳性的336份及处于检测灰区（S/OD值0.9-1）的3份标本共339份又进行了TPPA法检测，统计ELISA与TPPA检测阳性符合率，发现两者符合率随TP-ELISA检测S/OD值升高而升高，在TP-ELISA法测定值为1-6区间时，两者符合率为仅为43.8%(39/89）。因此对临床用ELISA法检测到（S/CO）低值样本时，用TPPA法开展确证实验尤为必要，并应结合临床表现加以判断，以减少因ELISA法假阳性发生而引起的误诊。
336例TP-ELISA阳性的患者中，经临床确诊的梅毒患者为228例，我们又选取了150例非梅毒患者进行TP-ELISA法，TPPA法，RPR法三种方法同时检测，并对比三种方法的应用价值。检测结果显示：在敏感性方面，检测梅毒特异性抗体的TP-PA法在一期梅毒及二期梅毒的检测敏感性略低于TP-ELISA法检测，但不具统计学意义；RPR法敏感性最低。RPR法检测的为梅毒非特异性抗体，即类脂质类抗体，其出现较特异性抗体晚，因此其在一期梅毒的敏感性要低于TPPA和TP-ELISA法，类脂质类抗体会随着梅毒有效治疗而逐渐消失，这也是引起RPR检测的检出率在各期梅毒均低于TP-PA及TP-ELISA的原因之一；在特异性方面，TP-PA法在三种检测方法中特异性最高，RPR法特异性最低。尽管如此，TPPA法和TP-ELISA法仍存在约1%的假阳性率，如老年患者、肿瘤患者、自身免疫性疾病患者、孕妇、长期吸毒患者，及部分合并其他螺旋体感染的患者均会引起特异性抗体检测的生物学假阳性反应，而且梅毒特异性抗体的阳性结果无法区分患者处于是发病期还是继往感染，因此不能够单纯依据检测结果进行诊断[7]梅毒，需结合临床症状进行判断，RPR法检测的抗体不具有特异性，许多疾病如结核病、麻风等在疾病过程中均产生类似抗体，故RPR法假阳性率较高。临床上，该法常用于通过观察滴度的变化来判断梅毒疗效或观察病程[11]。
梅毒血清学检验在临床诊断中占据重要地位，TPPA、ELISA敏感度与特异度均较好，在各期梅毒诊断中均具有良好的稳定性，是较为理想的血清学检测方法。RPR法灵敏度和特异度虽略低于前两者，但作为梅毒疗效评价方法成本低，操作简单，被广泛应用。TPPA或ELISA法联合RPR可作为梅毒筛查的可靠方法[12,13]，在提高阳性检出率同时减少假阴性率，并作为观察梅毒疗效及病程的重要指标，指导患者得到及时有效的诊治。对于梅毒检出阳性患者，临床医师还应结合病史、症状、体征等综合分析，以提高确诊率[14]。
参考文献
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