2.3 声光可调谐滤波器探测端应用
声光可调谐滤波器在探测端主要应用于多光谱成像和细胞分类统计系统中，作为大孔径角荧光波长选择器件发挥其快速、纳米级波长分辨能力。多光谱成像综合了光谱方法和成像方法两者的技术优势，实现了较宽光谱范围内同一物体不同中心波长的多次成像，同时获得包含二维图像信息和一维光谱信息的数据立方[10].较仅采用图像观察、分析细胞结构的方法，提供了更丰富的细胞结构信息并拓展了适用染料的种类，实现了相似光谱染料的高效区分，提高了信噪比。
德国 Anja Mittag 研究组系统的总结分析了相对于原有细胞成像方法，多光谱细胞成像的技术优势[11]:1）具备相似光谱特征荧光染料的区分能力：如 PE-cy5 染料与 PE-cy5.5 染料分别染色细胞的区分。2）具备多次重复染色并区分信号强度的能力：如采用三种相异的抗体交联同种染料分时细胞着色。同一样本经过三次原位染色洗脱再染色的过程，可以分析同一样本三种抗体的反应表达。3）具备细胞中荧光染料漂白前后染色效果的区分能力：同一样本不同染料的抗漂白能力差异较大。通过获取染料着色后漂白细胞的多光谱图像，可以较易区分FITC 与 ALEXA488,PE 与 ALEXA532 等染料。4）具备根据不同染料光激活能力不同而区分染料种类的能力。不同染料因性状不同，可以应用激光器进行激活操作，染料经激发光激活后荧光信号变强。5） 具备识别能量共振转移现象发生条件的能力：当能量共振转移发生时，可以同时在 accepter 与 donor 的光谱通道检测到光信号。当能量共振转移条件被破坏时，accepter光信号减弱，donor 光信号增强。6）具备识别 KAEDE 等特殊染料经紫外光激发后发射光谱波长移动的能力。7）具备指纹光谱识别能力，可同时测试较大视场内每个像素的光谱特征。通过双通道 AOTF 合成技术可进一步使系统具备 3 维光谱图像获取能力[12].
然而，传统多光谱成像方法中采取图像传感器件前加装窄带滤光片轮组的方式切换波长，存在成像波段数目较少，成像速度受机械结构限制的问题，且不具备相似光谱染料的鉴别能力。Nahum G 系统阐述了现阶段多光谱成像系统及其使用的滤波器件种类、性能，指出 AOTF 在多光谱成像应用中较液晶可调谐滤波器成本低且波长分辨率方面有优势[13].装配了 AOTF的系统可以实现多个中心波长的高速切换连续成像，极大的提升了系统成像速度，还可使系统具备荧光寿命成像能力[14].德国研究人员利用基于 AOTF 的多光谱成像系统观测由多重染色技术定位的细胞内部结构。通过二重染色技术获得由 GFP 染色细胞核、CFP 染色着丝粒的子宫颈细胞清晰图像。通过三重染色技术获得由 hoechst33342 染色细胞核、Rhodamine Red 染色细胞质、Hypericin 染色细胞器的细胞结构图像。但是，以往的多重染色技术受到可见区荧光染料种类难于超过 7 个的限制，不具备实现更复杂结构染色区分的条件。量子点技术可将发射波长拓展至近红外区域，提供了更多的染料种类。YuKyung Tak 等人提出了一种以高光谱量子点单细胞成像细胞术为基础的肿瘤异质性的准确定量预后、分类新模式[15].由于量子点存在较强的细胞毒性，难于广泛应用于活细胞的多重染色研究中。Plasmonic nanoparticles 技术提供了另一种可行的选择[16].杜克大学的研究人员利用不同纳米材料形状不同特征峰相异的特性，选用 600 nm 波长特征峰的纳米金棒交联 EGFR抗体，560 nm 波长特征峰的 60 nm 直径金球交联 HER-2 抗体，530 nm 波长特征峰 100 nm 直径银球交联 IGF-1R 抗体成像，验证了纳米粒子定量分析生长因子表达的可能性和实用性。由此可知，纳米粒子可作为荧光染料和量子点外的第三种选择，且颗粒尺寸丰富、波长选择范围较宽。应用染料波长峰值接近而选择受限的问题还可由 AOTF 的波长高分辨能力结合数据线性分离的方法得以解决[17].多通道荧光图像数据线性分离是多重染色细胞结构定位的关键，其核心技术是通过 AOTF 的高速成像通道波长选择能力获得同一对象的多幅光谱图像，应用线性分离算法解决细胞染料结构定位中光谱重叠的问题。线性分离算法分为 6 步实现：1 应用 n 种染料分别染色样本；2 获取至少 n 个通道单染料的荧光图像；3 计算 n 种单染染料图像 n个通道数据后，分离各通道的背景信号；4 获取多重染色目标样本的 n 个荧光通道图像；5 应用步骤 3 的方法逐点处理图像中像素间不同染料的荧光串扰；6 最后输出多重染色细胞结构图像结果。
AOTF 多光谱成像系统不仅可用于细胞图像结构分析还可基于细胞图像识别计数的方法分析细胞种类和细胞周期。传统的流式细胞术光谱通道相对固定，应用 AOTF 技术则相当于细胞计数系统具备了多个光谱通道，获取光谱图像后对细胞进行图像识别，分类统计不同荧光通道内不同强度的细胞，可以快速识别特异性细胞、分析细胞周期[18].普度大学 Bartek Rajwa等人搭建的低成本多光谱细胞成像计数系统[19],光谱通道带宽可控制于 6 纳米以下。由于细胞计数应用无需更高的光谱分辨率，该系统较推扫成像光谱方法和傅立叶变换方法具有更简单的系统结构。实验获取 522 nm-562 nm 光谱范围内 2 nm 分辨率的多光谱图像，可以有效区分具有非常相似的光谱的 DiOC6（3） 和 DiBAC4（3） 染色的淋巴细胞。基于多光谱成像的细胞统计方法中，一项重要的统计特性是依据荧光强度判定细胞中功能成分的多寡。如 PI、hoechst33342 等染料特异性亲和 DNA,可以通过 PI 染色的样本图像区分倍体细胞，进而确定样本所处细胞周期中的阶段。还可以对于细胞群的细分研究则需要优秀的算法提高图像识别结果的准确性。首尔大学的研究人员基于声光可调谐滤波器的统一阈值描述方法实现细胞种群的快速定量分析，用于白血病的药物敏感性筛选工作。实验中应用AOTF 设置荧光强度统计阈值，统计区分喜树碱、釉皮素、水杨酸钠等不同药物成分、不同用量作用下的白细胞状态，评估人骨髓白血病细胞 HL-60 在药物作用下的存活能力。相似结构的系统也用于药物心肌毒性研究，通过观测钠、钾离子通道通透性，识别药物作用机制。因此，基于 AOTF 的多色成像系统在药物开发方面与膜片钳技术一样具有巨大的潜力[21],可以直接定量细胞的药物反应，实现自动化的药物细胞毒性监测。
区别于固定样本位置的多光谱成像细胞统计方法，AOTF在流式细胞计数系统中也可作为滤光元件实现探测通道荧光波长的高速选通。美国橡树岭国家实验室的研究人员利用流式细胞系统的开放性，将声光可调谐滤波器作为分光元件结合ICCD,对单列流动不同颗粒的染料光谱特征进行了分析。获取罗丹明 123 和荧光黄在 450 nm-650 nm 波长范围内不同发射波长的一系列多光谱图像。实现细胞等生物颗粒的基于图像光谱信息的高速流式识别统计，该系统还具备应用光谱线性解析方法进一步实现样本多重染色的分离计数能力，极大的拓展了原有流式细胞系统的应用范围[22].
3 未来展望
本文对声光可调谐滤波器的原理和其在细胞生物学中应用做了简明扼要的论述，使广大科研人员对声光可调谐滤波器光谱带宽窄、响应速度快、操作方便的功能特点有了进一步的认识。可以预见，随着铌酸锂等新型声光材料性能的不断开发应用，响应速度发展至微秒级甚至纳秒级、光谱分辨率提升至1 至 0.1 纳米的高效滤波器件将会出现。届时，高光谱成像分析系统将有能力实现上百个谱段的单细胞实时成像为细胞高通量光谱统计分析处理提供手段，提升细胞表型分析的准确程度，获得更丰富的药物细胞毒性分析数据，为研究人员获取新的结果提供有益的手段，为细胞结构功能的深入研究、基于细胞层面的个性化诊疗奠定基础。
衷心感谢国家科技部 863 项目和苏州市应用基础研究计划基金的支持。
参考文献（References）
[1] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as amarker for gene expression [J]. Science, 1994, 263（5148）： 802-805
[2] Takeharu N, Keiji I, Eun S P, et al. A variant of yellow fluorescentprotein with fast and efficient maturation for cell-biologicalapplications [J]. Nature Biotechnology, 2002, 20（1）： 87-90
[3] Nathan CS, Paul A S, Roger Y T. A guide to choosing fluorescentproteins[J]. Nature Methords, 2005, 2（12）： 905-909
[4] Pawley J. Handbook of biological confocal microscopy [M]. NewYork: Springer, 2006: 43-58
