前言
细胞生物学研究中，科研人员的常用研究方法是利用染料标记细胞或细胞内功能区，并通过荧光显微、共聚焦成像等方法分析细胞结构形态与功能、通过探针荧光强度统计方法分类细胞[1,2].这些方法的共性是通过检测特异性染料发出波长的种类与强度区分细胞种类和功能[3].可检测的荧光参数通道越多，可分析的荧光探针种类越多，就越有助于实验中对细胞进行细致的分析[4].因此衡量研究系统功能丰富与否的直观手段是其支持光源与荧光参数种类的多少。为了实现荧光波长参数的有效区分与探测，上述系统结构中通常都包含滤光结构以实现光源波长以及荧光探测通道的选择。常用的滤光结构包括：D由不同种类的长通、短通和带通滤光片组合搭配构成滤光结构。2）由具备光色散能力的元件如光栅、棱镜等构成滤光结构。3）由可调谐波长选择元件，如声光可调谐滤波器或液晶可调谐滤波器构成滤光结构。其中，声光可调谐滤波器是近年来发展的，基于声光相互作用原理实现波长选择的新型滤光器件，具有无机械结构、波长分辨率高、微秒级响应、孔径角较大等优点[5].为了深入了解声光可调谐滤波器特性，充分发挥其在高光谱成像、细胞分类识别系统中微秒级波长选择与功率调制功能。本文从应用的角度出发，归纳总结了 2 种主要应用模型，探讨了系统采用声光可调谐后在光谱分辨能力和细胞功能识别方面的技术优势。
1 声光可调谐滤波器的原理结构与技术指标
声光相互作用现象于 1930 年被美国的 Debye and Sears 首次报道，直至 1975 年非共线声光滤波器首次出现，因性能的极大提高而得到广泛应用[6].目前，声光可调谐滤波器（Acous-to-Optic Tunable Filter ,简称 AOTF）器件的作用范围可以覆盖可见光到短波红外区域[7].构成 AOTF 器件最常见的声光晶体材料是二氧化碲晶体或石英晶体。
1.1 声光可调谐滤波器原理结构
声光可调谐滤波器通常由声光晶体、换能器、吸收介质、射频源组成。其功能是从复色输入光中分离与射频源输入信号频率高度相关的单色光。
AOTF 技术依赖于超声波与光波在声光晶体中的共同传播，其作用类型包括共线型与非共线型。常用的声光可调谐滤波器为非共线型，即声波和光波以不同角度传播通过晶体。晶体的一侧通常连接超声换能器将射频源的输入信号转化为超声波。当声波穿过声光晶体时导致晶格交替压缩与放松，发生折射率调制现象，相当于晶体中形成了光栅，并随着声波的传播而在晶体中移动。与声波交叉传播的光波通过上述折射率调制区域后发生声光衍射现象。光在声光晶体中的传播特性不同于传统衍射光栅，因此 AOTF 只衍射特定波长的光且波长与输入射频频率高度相关。由于偏振方向差异，衍射光将形成两个一级衍射光束，被称为 +1 级光和 -1 级光，声光可调谐滤波器原理如图 1 所示。实验装置中通常应用光阑阻止其中的一级而利用另一级光束。
1.2 声光可调谐滤波器的技术指标
描述声光可调谐滤波器性能最重要的参数包括：声光可调谐滤波器中心波长选择能力和光谱分辨率等[5].
声光可调谐滤波器中被选择单色光的波长是施加于声光晶体上超声频率的函数。因此，通过改变声波频率，可以改变偏转分离的单色光中心波长。中心波长 与声波频率 的关系是
2 声光可调谐滤波器的细胞生物学应用
2.1 声光可调谐滤波器的细胞生物学应用模型
由于声光可调谐滤波器具有响应速度快、波长选择能力强的特点而得以广泛应用。按照声光可调谐滤波器在系统中功能的不同，应用模型主要分为两类。一是将 AOTF 应用于荧光的激发光源端，实现光源波长的选通和功率调制。光源发射的光经声光可调谐滤波器选择特定波长后用于样本激发，避免了光源较广泛的发射光谱作用于荧光染料而产生相互干扰。较简单的应用实例是 AOTF 用于氩离子激光器 488 nm、514 nm 两条谱线的选择输出。另一类主要应用是将 AOTF 应用于目标荧光染料波长的检测端，作为光谱滤波器实现多光谱应用或指纹光谱测量。两种应用的原理模型示意图如图 2、3:
2.2 声光可调谐滤波器光源端应用
光源是细胞生物学研究系统中常用组件，根据使用功能的不同如：照明、激发、烧蚀等选择不同的光源种类。共聚焦、多光子显微术、光镊、流式细胞术等技术推动了光源性能的高速发展，提出了新的应用需求。目前，激光器已在较广的应用领域中替代了传统的汞灯、氘灯、卤素灯等，但是单激光器波长固定，往往难于满足复杂使用条件下对光源波长的需求。应用 AOTF搭配高功率汞灯实现线状谱选通较好的解决了照明中波长变换的要求，但能量利用率偏低，且难于达到更高的光功率密度。
超连续光源的出现是光源发展历程中的一大重要进步，配合AOTF 系统可实现光源光谱范围内连续的波长选择，同时具备百兆级的重复频率，可部分替代钛宝石激光器，满足双光子和二次谐波显微系统中的应用。Brimrose 公司提供的连续可调光源系统波长选择范围是 450-650 nm,波长分辨率可达 2 nm.
Fianium 公司提供的超连续光纤激光光源的输出波长范围覆盖480-2400 nm,可见波段的功率密度平均值大于 5 mw/nm[8].配合 8 通道 AOTF 系统实现了输出波长与荧光染料吸收峰的精密匹配，可获得更高的信噪比，实现微弱表达细胞的检测。与之相似，NKT Photonics 公司也提供了可与超连续光源匹配的声光可调谐滤光系统，通过双波段的晶体配合实现了最高通道数可达 16 通道的高速调制光源。法国 Nelly Rongeat 等研究人员利用 AOTF 光源系统高速调制光功率，恰当控制由 491 nm 和561 nm 双波长激发偶联了抗 CD20 和抗 CRTH2 的 PE-cy5 与噻唑橙染料的荧光激发强度，实现常规实验中因表达微弱难于测定的嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞的识别分析，获得了较传统细胞计数仪器更高信噪比[9].
