血管内皮细胞具有产生和分泌多种生物活性物质、调节血管舒缩、抗凝血、维持血管内稳态等多种生理功能。内皮细胞在血栓与止血、血管新生、炎症及免疫反应等一系列病理过程中也起着关键的作用。随着人们对心脑血管疾病研究的深入，血管内皮细胞的许多功能被不断发现和重新认识。由于高血压、动脉粥样硬化、心脑血管梗塞、肿瘤等疾病的增加，引起人们对血管性疾病的病因、发病机制、发生发展过程等给予更多地关注。血管内皮细胞是研究血管功能和心血管疾病重要的工具之一，而血管内皮细胞的分离和体外培养是研究其功能的基础。
血管内皮细胞通常从其形态学特征、CD31 表达等方面进行鉴定。目前，大多数学者选用脐静脉分离内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)作为研究模型，国内外均未见有分离人动脉内皮细胞方法的报道。因为具有活性的人源动脉十分稀有、不易获得且取材有一定难度，所以对动脉系统特别是动脉内皮的研究多用大鼠、猪或牛的动脉细胞来替代，也有学者使用人主动脉内皮细胞进行分析研究，多数为购入的商品化细胞，受人体材料来源的限制，价格十分昂贵。灌流消化法是利用健康产妇正常分娩的胎盘脐带分离脐动脉内皮细胞( human umbilical arterial endothelial cells，HUAEC) ，取材容易，方法可靠，操作简便，细胞成功传代培养并鉴定。
1 材料和方法
1． 1 材料
1． 1． 1 主要试剂和仪器 HepG2 人肝癌细胞为北京大学生命科学学院顾军教授惠赠，人胚肾 293A 细胞系为北京大学分子医学研究所朱晓君老师惠赠，M199 培养基、胎牛血清购自 Gibco 公司，1 型胶原酶购自 Worthington 公司，成纤维细胞生长因子购自 Peprotech 公司，肝素钠、青霉素、链霉素和化学试剂购自 Sigma 公司，鼠尾胶原、Matrigel 胶、小鼠抗人CD31 抗体购自 BD 公司，小鼠 IgG、荧光标记的山羊抗小鼠IgG 抗体购自中山金桥公司，S100 倒置相差显微镜购自日本Nikon 公司，IX2-SP 荧光显微镜购自日本 Olympus 公司，小鼠灌胃针头购自苏州市苏杭实验动物设备厂。
1． 1． 2 标本收集 无菌条件下分离正常妊娠足月分娩的新生儿脐带( 北京海淀妇幼保健院产科，孕妇产前检查 HBsAg、衣原体、人免疫缺陷病毒及梅毒均阴性) ，低温 4℃保存在含青、链霉素的 PBS 中，6 h 内完成分离细胞的操作。本项研究经北京市海淀妇幼保健院科教科及北京大学伦理委员会批准，产妇知情并志愿捐献。
1． 2 方法
1． 2． 1 培养基及胶原酶溶液的制备 M199 基础培养基，添加 200 mL/L 胎牛血清、5 ng/mL 成纤维细胞生长因 子( fibroblast growth factor，FGF) 、肝素钠、青霉素、链霉素等添加剂。配制 0． 1 g/L 的胶原酶溶液，用不含 Ca2 +、Mg2 +的Hanks 液加 1 型胶原酶，0． 22 μm 滤膜滤过除菌，置 37℃ 待用。
1． 2． 2 HUAEC 的分离 无菌条件下取出脐带，在生物安全柜内剪去钳痕和凝血块阻塞部分，剪成 8 ～10 cm 一段，在脐带一端剥离暴露出其中1 条脐动脉，用特制针头( 可用小鼠灌胃针头代替) 轻轻插入脐动脉断端，可反复操作至针头大部分进入动脉管腔，结扎固定针体，用 20 mL 一次性注射器吸取 PBS 后连接针头，反复灌流冲洗脐动脉 2 遍，将管腔内残血冲洗干净，然后注入 37℃预热的 1 型胶原酶溶液，待血管出口处有溶液流出时，用止血钳夹闭出液端，使血管腔充盈饱满后，将其置入 37℃培养箱中，消化 15 min。清洗和灌注时不要用力过大，否则消化液会冲破血管壁，进入组织间隙。
取出消化好的脐带，沿夹闭端止血钳内侧剪断脐带，收集脐动脉内的消化酶溶液，然后注入 PBS 再次冲洗动脉管腔，以获得更多的内皮细胞，将消化后的酶溶液和冲洗液一并注入50 mL 离心管，1 200 r / min，离心 5 min，弃去上清，加入M199 培养基打散细胞制成细胞悬液。
1． 2． 3 HUAEC 培养 用 0． 02 μL / mL 的鼠尾胶原预包被细胞培养瓶 37℃，30 min，接种细胞前吸去包被液。将细胞悬液按( 1 ～ 3) × 105个细胞接种于 25 cm2的培养瓶，置于37℃ 、50 mL / L CO2条件下培养，1 h 后即可观察到有部分细胞贴壁，12 h 时后更换培养基去除未贴壁细胞，2 ～3 d 换液1 次，至细胞刚好融合时传代。弃去培养瓶中的培养基，用PBS 清洗 1 次，然后加入 1 mL 含 0． 02 g / L EDTA 的 0． 5 g / L胰蛋白酶消化液，37℃，5 ～8 min，待细胞回缩变圆、浮起后加入 M199 培养液终止消化，用吸管轻轻吹打混匀，收集细胞悬液，1 200 r/min，离心5 min，弃去上清，用 M199 培养液重悬细胞按1∶3 比例接种传代，每次传代时密度不可太低，传代后 2 d 左右细胞进入对数增长期，增殖较快，3 ～ 4 d 即可再次传代，1 条脐动脉分离的 HUAEC 经过 2 次传代可获得( 6 ～8) ×106的细胞。
1． 2． 4 HUAEC 的形态学鉴定 利用倒置相差显微镜观察活体细胞的形态特点。
1． 2． 5 免疫荧光染色检测培养细胞的 CD31 表达 在 6 孔板内放置无菌盖玻片 22 mm × 22 mm，将内皮细胞悬液和对照细胞接种于盖玻片上，待细胞长至融合时，吸去培养液，用PBS 清洗盖玻片，加入甲醛溶液固定 15 min，用 PBS 冲洗，再加入含有 BSA 和 Tween-20 的 PBS 溶液室温孵育 1 h，PBS 冲洗3 次，在盖玻片上滴加小鼠抗人 CD31 抗体工作液，另一盖玻片滴加 IgG 工作液作阴性对照，放入湿盒内，室温孵育 1 h。
用 PBS 冲洗3 次，每次10 min，滴加 Alexa fluor?488 标记的抗小鼠 IgG，室温孵育 30 min，用 PBS 冲洗 3 次，每次 10 min，用 DAPI 工作液复染细胞核，封片后荧光显微镜下观察结果。
1． 2． 6 HUAEC 管状结构形成试验 在 48 孔细胞培养板内加入预冷的 Matrigel 胶，200 μL/孔，放置37℃，30 min，使之凝固。将 HUAEC 和人胚肾293A 细胞，分别按( 6 ～8) ×104/ mL的密度重悬在 M199 培养基中，取出 48 孔板加入细胞悬液200 μL / 孔，置于 CO2培养箱中。3 h 左右观察并记录形成管状结构情况，人胚肾 293A 细胞作为对照。
2 结果
2． 1 内皮细胞的形态学观察 倒置相差显微镜下观察，分离培养的细胞为单层生长，呈铺路石样镶嵌排列( 图 1A) 。原代培养时，接种于培养瓶后 1 h 左右开始贴壁。最初细胞呈椭圆形，后逐渐伸展呈菱形，胞质丰富，胞核清晰可见，为圆形或椭圆形，细胞间可见相互连接。3 ～4 d 后，细胞基本融合。传代细胞较原代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞( 图1B) 。【图1.略】
2． 2 内皮细胞特异性膜蛋白 CD31 的表达 荧光显微镜下可见内皮细胞胞膜呈特异性绿色荧光，细胞核 DAPI 染色为蓝色。HUAEC 免疫荧光染色的结果显示小鼠 IgG 呈阴性( 图 2A) ，特异性膜蛋白 CD31呈阳性，且表达部位集中于细胞膜和细胞连接处( 图 2B) 。该染色结果和表达水平与阳性对照组( HUVEC) 相类似( 图2C、D) ，而阴性对照组( HepG2人肝癌细胞) CD31 无表达( 图 2E、F) ，说明该阳性染色细胞为 HUAEC。【图2.略】
2． 3 血管内皮细胞管状结构形成实验 HUAEC 在基质胶表面呈浸润生长、伸展，逐渐变形呈梭形，相互缓慢连接，形成大小不一的管腔样结构( 图 3A、B) ，对照组 293A 细胞呈圆球状分散分布，无管状结构形成( 图 3C、D) 。【图3.略】
3 讨论
近年来随着高血压、冠状动脉粥样硬化、心脑血管梗塞等动脉血管性疾病多发，有关动脉血管内皮细胞功能研究成为热点，但受人体动脉材料来源限制，目前此类研究多以 HUVEC 或动物主动脉内皮细胞作为模型进行分析。然而，动脉和静脉之间存在组织特异性，其内皮细胞生物学特性也存在差异，如: 动脉内皮细胞和静脉内皮细胞中 VWF 含量不同等。此外，动物动脉内皮细胞与人动脉内皮细胞在生理功能和生物学特性等方面也有较大差异。因此，人体组织来源的动脉内皮细胞具有静脉内皮细胞和动物组织来源的动脉内皮细胞不可替代的优势。这一点已经为高血压病理模型、脉冲式牵张力、剪切力等研究所证实。
目前动脉内皮细胞分离方法主要有组织机械刮脱法、组织块培养法和组织消化法。机械刮脱法系直接刮剥血管壁内皮层获取细胞，对内皮细胞损伤大，影响细胞胞吐、迁移等多种功能; 组织块培养法是采用长时间培养血管组织，使细胞增殖、迁移后获取细胞，该方法无法避免血管平滑肌、成纤维等非内皮细胞混杂其中; 也有学者采用在剪开的血管内壁表面滴加酶溶液消化后，回收培养，分离内皮细胞，受材料小和操作过程复杂限制，获取细胞数量较少，极易污染。本研究采用灌流胶原酶消化脐动脉分离内皮细胞，避免了上述 3 种方法的不足之处，获得细胞数量多、杂细胞少，对细胞的损伤小，减少了细胞被污染的几率。经消化分离出的细胞呈铺路石样排列、内皮细胞特异性膜蛋白 CD31 表达呈阳性反应、HUAEC 通过自我组装，在 Matrigel 上培养后能分化形成管状结构，结果显示内皮细胞特征明显。
血管内皮细胞原代培养存在传代生长缓慢以及贴壁困难等问题。本研究发现原代分离培养的HUAEC状态与脐带离体时间密切相关，脐带离体后随着时间延长，内皮细胞的活性逐渐下降、细胞状态变差。有研究表明，脐带离体超过 6 h 后易出现水肿、变性、活力下降，内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原释放量以及前列环素生长量均随着时间的延长而呈下降趋势。另外，在本实验中于原代细胞接种前用鼠尾胶原或纤维蛋白胶原预包被细胞培养瓶，在培养瓶表面形成一层基质膜，有利于细胞贴壁、伸展、迁移和增殖，有效的解决了细胞贴壁难的问题。
以上研究结果证明采用胶原酶灌流消化法分离、培养 HUAEC，取材方便，操作过程简单，分离所获得的细胞可以在体外连续大量增殖传代，解决了人源动脉内皮细胞获取难的问题，为进一步研究动脉血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系奠定了基础。
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