神经干细胞( neural stem cells,NSCs) 是分布于神经系统内的具有自我复制、增殖能力和多向分化潜能的细胞群,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,是替代损伤神经细胞的潜在内生性资源。近年来,Bennett等在室周器官( circum-ventriculer organs,CVOs) 发现了神经干细胞,穹窿下器( Subfornical organ,SFO) 作为一个较大的室周器官,缺乏血脑屏障,很多大分子都可以通过,是脑神经再生和修复的重要位点之一。本研究利用免疫组化及免疫荧光双标法,分别对 SAMP8 小鼠穹窿下器中溴脱氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine,Br-dU) 、性别决定基因高迁移率组蛋白( sex determiningregion Y) ,SOX2 以及巢蛋白( Nestin) 阳性细胞分布进行观察。
材料和方法
1、 材料
SMP8 小鼠 20 只,8 月龄,体重 18 ~ 22 g,雌雄不限,均为二级实验动物,由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供( 清洁级,合格证号: W-J 津实动质 M 准字第 006 号) 。
2、 方法
2. 1 分组 随机分为四组,每组 5 只。一组按每只50 ㎎ / ㎏溶于 0. 3 ml 生理盐水的剂量,腹腔注射 Br-dU( 美国 SIGMA 公司) ,连续五天给药,每天两次,间隔 8 h,第六天进行 BrdU 免疫组织化学染色。另外三组,分别用于 SOX2、Nestin 免疫组化染色及Nestin / SOX2 免疫荧光双标染色。
2. 2 实验流程
2. 2. 1 麻醉动物 开胸经主动脉灌注 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液( 0. 1 mol/L,pH 7. 2) ,灌注完毕,取出整脑放入 4%多聚甲醛后固定过夜。用于免疫组化的标本,梯度酒精脱水、浸蜡、包埋,Leika 切片机连续切片,切片厚度 5 μm,并于显微镜下确定位置,分别用于 BrdU、Nestin 和 SOX2 免疫组化染色; 用于免疫荧光双标的标本,依次 15%、30% 蔗糖溶液组织脱水,Leika 切片机连续冰冻切片,切片厚度 10 μm,显微镜下确定位置,然后进行 SOX2/Nestin 免疫荧光双标染色。
2. 2. 2 免疫组织化学染色 ( 1) BrdU 免疫组织化学染色: 石蜡切片常规脱蜡至水,50% 甲酰胺抗原修复液中微波修复 20 min,冷却后,2 × SSC 冲洗 3 min× 2 次,0. 3% Trition 室温下 15 min,2 mol / L 的盐酸中室温下 30 min,0. 1 mol/L 的硼酸缓冲液 5 min,0. 05% 胰蛋白酶 37℃ 下消化 20 min。10% H2O2封闭内源性过氧化物酶 10 min,10% 山羊血清 37℃下封闭 30 min。加入一抗,小鼠抗 BrdU 单克隆抗体( 美国 SIGMA 公司) ( 1∶ 100 稀释) ,4℃冰箱孵育过夜。生物素标记山羊抗小鼠 IgG,37℃温箱湿盒内孵育 30 min,辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃温箱湿盒内孵育30 min。DAB 显色,苏木精溶液复染,常规酒精脱水、透明、封片,Olympus BX-UCB 显微照相系统观察摄片。以上步骤除血清封闭后直接一抗外,其余各步间用 0. 01 mol/LPBS( pH 7. 2 ~7. 4) 冲洗 5 min × 3 次。DAB 显色,苏木精溶液复染,常规酒精脱水、透明、封片,Olympus BX-UCB 显微照相系统观察摄片。同时设阴性对照: 一抗加0. 01 mol/LPBS( pH 7. 2 ~ 7. 4) ,其他步骤同前; 且以侧脑室室下区作为阳性对照; ( 2) Nestin 免疫组织化学染色:
石蜡切片常规脱蜡至水,柠檬酸缓冲液中微波修复20 min,冷却后,10% H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min,10% 山羊血清封闭 37℃ 下封闭 30 min。加入一抗,单克隆小鼠抗 Nestin 抗体( 美国 SIGMA 公司) ( 1∶ 50 稀释) ,剩余操作方法同 BrdU 免疫组化染色; ( 3) SOX2 免疫组织化学染色: 除一抗为多克隆山羊抗 SOX2 抗体( 美国 SIGMA 公司) ( 1∶ 700 稀释) 外,其他操作方法同 Nestin 免疫组化染色。
2. 2. 3 免疫荧光双标染色 冰冻切片依次浸入0. 01 mol / L PBS( pH 7. 2 ~ 7. 4) 10 min、0. 3% TritonX-100 中 15 min,然后 10% 山羊血清 37℃ 下封闭 30min。加入一抗,鼠抗 Nestin 单克隆抗体 ( 1 ∶ 50 稀释) 及山羊抗 SOX2 多克隆抗体( 1∶ 500 稀释) ,4℃冰箱孵育过夜。避光加入二抗: FITC 标记鸡抗小鼠IgG 荧光抗体( 1 ∶ 50) 稀释,罗丹明兔抗山羊荧光抗体( 1∶ 500 稀释) ,37℃ 温箱湿盒内孵育 2 h,室温孵育 30 min。以上步骤除血清封闭后直接一抗外,其余各步间用 0. 01 mol/L PBS( pH 7. 2 ~ 7. 4) 冲洗 5min × 3 次,加入荧光二抗后要避光冲洗。50% 甘油封固,Olympus BX-UCB 显微照相系统观察摄片。
2. 3 阳性细胞计数 BrdU 阳性表达细胞的细胞核呈棕褐色,阴性细胞细胞核为蓝色。SOX2 阳性细胞的细胞核呈棕褐色,阴性细胞细胞核为蓝色。Nestin 阳性细胞的细胞浆为棕褐色,阴性细胞的胞浆无染色。
结果
1 BrdU、SOX2 及 Nestin 阳性细胞在穹窿下器的分布1. 1 BrdU 组织化学染色 在 SMP8 小鼠穹窿下器连续切片上,BrdU 阳性标记细胞的胞核呈棕褐色或棕黑色,着色不均匀,深浅不一。阳性标记细胞有的散在分布,有的成对分布,细胞核较小,有的呈椭圆形,有的形状不规则( Fig. 1A) 。
1. 2 SOX2 组织化学染色 SOX2 阳性细胞的胞核染色深浅不一,呈棕色或棕褐色,在室管膜区和大血管周围分布密集,其他部位散在分布。高倍镜下可见阳性细胞胞核多呈圆形或椭圆形,细胞核长 2. 5~ 5. 5 μm,宽 1. 8 ~ 4. 0 μm( Fig. 1B)。
1. 3 Nestin 组织化学染色 Nestin 阳性表达细胞的胞浆为棕色或棕褐色,大小不一,有多个数目不等的分支,细长的突起相互交织,呈絮状或丝状,在室管膜下区分布密集,背侧区分布较少,在两侧大血管周围呈放射状分布。高倍镜下可见到粗大的阳性颗粒,放射丝长11 ~45 μm,宽0.6 ~1.5 μm( Fig.1C) 。
2 SOX2、Nestin 阳性标记细胞在穹窿下器的分布SOX2 阳性细胞胞核为红色,在室管膜区密集表达,其他部位散在分布,胞核大小不一,形状不等,在室管膜区排列整齐,胞核长 1 ~5 μm,宽 1 ~3. 5 μm( Fig. 2A) 。Nestin 阳性表达细胞为绿色,呈丝絮状或云片状分布,彼此交织,丝状结构长 15 ~ 35 μm,在室管膜下区和中央区分布密集,联合成片状( Fig. 2B) 。穹窿下器内可见散在的 SOX2/Nestin 双阳性细胞( Fig. 2C) 。
讨 论
阿尔茨海默病( Alzheimer disease,AD) ,是伴随有进行性的认知功能障碍和记忆能力损害的一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病,其重要的病理改变之一就是大量神经元的死亡,因此以神经生发为基础的诊疗方法诊治 AD 已成为研究的热点。快速老化痴呆模型小鼠 SAMP8 是目前公认的理想的自然衰老痴呆模型,广泛应用于 AD 的研究。本研究通过对 SAMP8 小鼠穹窿下器中神经干细胞阳性标记物的表达和分布进行观察,来进一步了解早期 AD 患者脑内神经干细胞/祖细胞的分布规律。
神经干细胞是 Reynolds 等从成年小鼠纹状体分离出的能在体外不断分裂增殖并具有多种分化潜能的细胞群,目前有研究发现,哺乳动物的嗅球、海马、侧脑室的脑室区、室下区等均发现有神经干细胞存在,在适宜的条件下,神经干细胞可以自我增殖和多向分化,为研究及治疗中枢神经系统疾病提供了新的途径。神经干细胞/祖细胞的检测特异性标记物常用的有 BrdU、SOX2 及 Nestin 等。BrdU 是一种胸腺嘧啶核苷的衍生物,在细胞有丝分裂的 S 期,能代替胸腺嘧啶掺入到细胞合成的 DNA 中,成为一种细胞增殖的标志。本研究通过给 SAMP8 小鼠连续5 d 腹腔注射 BrdU,在 SFO 内发现有 BrdU 阳性细胞,这些细胞成对或散在分布,这说明 SAMP8 小鼠穹窿下器存在有可以增殖的细胞,可能就是具有增殖、分化功能的神经干细胞/祖细胞。SOX2 是一种转录因子,表达于细胞核,能促进神经干细胞的转录,参与神经干细胞的维持。SFO 内 SOX2 阳性表达进一步提示了 SFO 可能存在有神经干细胞/祖细胞。Lori Bennett 等在成年大鼠侧脑室室下区、终板血管器、海马齿状回、最后区等部位发现了SOX2 的阳性细胞,我室李力等在成年大鼠的室周器官之一最后区也发现了 Nestin 及 SOX2 阳性细胞,这支持了我们的推断与发现。同时,SOX2 阳性细胞在室管膜区和大血管周围分布密集,说明该处的细胞处于活跃期,因 SOX2 在许多正常组织细胞中都可以阳性表达,SOX2 阳性的细胞尚不能明确为神经干细胞/祖细胞。
我们进一步研究发现,在 SAMP8 小鼠穹窿下器内 Nestin 也有明显阳性表达。Nestin 属于Ⅵ型中间丝纤维蛋白,是主要细胞骨架蛋白,存在于神经上皮的干细胞,在神经细胞形成期开始高表达,在神经细胞迁移和分化后逐渐消失,是应用最早也是应用最广泛的神经干细胞标志物之一。SAMP8 小鼠穹窿下器 Nestin 阳性表达进一步说明该室周器官可能存在神经干细胞/祖细胞。Nestin 阳性细胞在室管膜下区分布密集,说明该区的神经生发功能可能比周围组织旺盛,与我们 SOX2 免疫组化研究结果一致。
同时我们的结果表明,Nestin 的表达低于 SOX2 的表达,提示部分 SOX2 阳性细胞可能不是神经干细胞/祖细胞。免疫荧光双标染色中穹窿下器内存在SOX2 / Nestin 双阳性表达细胞,进一步提示 SAMP8小鼠穹窿下器存在神经干细胞/祖细胞的可能性。
SFO 是一体积较大的室周器官,具有浓密而复杂的窗性毛细血管,缺乏血-脑屏障,并且处于脑-脑脊液界面上,是脑的开窗,是神经系统与免疫系统之间信息交流的通道,极易受到脑内环境改变的影响。这种独特的组织学结构,必然导致此处为血液中有害物质侵入脑组织的位点。因此,穹隆下器必然存在着强大的修复功能,同时意味着神经干细胞在脑损伤时将会因微环境的改变而出现大量的增生、分化和迁移。因此我们认为,研究 SAMP8 小鼠穹隆下器神经干细胞/祖细胞将为进一步探讨 AD早期的病理改变和诊治提供相应的依据。
