摘 要： 通过重建老化皮肤细胞的体外评估模型，评估龙血复合物（一种由4种活性成分复合而成的活性物）对正常人皮肤成纤维细胞和表皮角质形成细胞ATP含量和线粒体完整性（包括：线粒体形态、线粒体网络和线粒体融合蛋白-1的表达）的影响。ATP检测试剂盒测定成纤维细胞和角质形成细胞内ATP含量，荧光探针染色结合显微镜图像半定量方法评估线粒体形态和线粒体网络结构的丰度，免疫细胞荧光染色方法分析线粒体融合蛋白-1(Mfn1)的表达。实验结果显示，龙血复合物显着促进成纤维细胞和角质形成细胞ATP含量，显着促进角质形成细胞线粒体网络的形成，龙血复合物处理的成纤维细胞线粒体形态完整、碎片较少、具有更加丰富的分支结构，Mfn1的表达水平更高。研究发现龙血复合物通过促进细胞ATP产生、保持线粒体完整性、增加线粒体网络数、促进Mfn1的表达，显示出对成纤维细胞和角质形成细胞的抗衰老作用。本研究中使用的评估方法也可用于筛选针对与线粒体衰老和生物能量相关功能的活性成分。
关键词 : 皮肤衰老;龙血复合物;线粒体;线粒体网络;线粒体融合蛋白-1;
Abstract： In this study, normal human skin cells extracted from an aged donor were used to establish the in vitro senescent skin cell model. The bioenergetics effect was evaluated by measuring cellular ATP content using CellTiter-Glo? Reagent. Microscopic inspection and the semi-quantitative analysis methods of mitochondrial networks have been used to evaluate the mitochondria assembled into flexible networks in metabolically active cells. In the meantime, immuno-cytochemistry staining was used to futher understand the mechanism of mitochondria network formation, and the expression of Mitofusin-1 was investigated. With this model, the efficacy of Dragon's Blood Complex( DBC), a botanical complex composed of four active ingredients, was evaluated with normal human dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes about its biofunctions on ATP production and mitochondrial integrity including morphology of mitochondria, aboundance of mitochondrial networks, and the expression of Mitofusin-1. The results show that the ATP level in senescent fibroblasts and keratinocytes is significantly increased by Dragon's Blood Complex. The relative ATP content of fibroblasts is 117.7%±4.3% compared with the control group( P<0.01) when treated with 0.25% DBC. When treated with 0.5%, 0.25%, and 0.1% DBC, the relative ATP content of keratinocytes, compared with the control group, are 149.8%±9.0%, 147.5%±6.4%, and 134.0%±8.3%, respectively( P<0.001). By incubation with 0.25% DBC, the count of mitochondrial network in senescent keratinocytes is significantly promoted( P<0.05). And in the DBC-treated fibroblasts, the mitochondria networks are less fragmented and more extensively branched in morphology. Besides, Mitofusin-1 is more widely and abundantly expressed in the DBC-treated fibroblasts. This might partly explain the promotion effect of DBC on mitochondria networks. In summary, DBC shows anti-aging effects on fibroblasts and keratinocytes by promoting the cellular ATP and mitochondria. The evaluation method used in this study can also be applied to the screening of more active ingredients targeting the functions relevant with mitochondrial aging and bioenergetics.
Keyword： skin aging; Dragon's Blood Complex; mitochondrion; mitochondrial network; Mitofusin-1;
皮肤作为人体最大的外层器官，是衰老最明显的表现。皮肤衰老体现了皮肤完整性和功能性的下降。与衰老相关的生物学过程中，线粒体能量产率下降、ROS产量上升，线粒体自噬水平下降，其功能异常成为加速细胞衰老的关键因素[1,2,3]。众所周知，生物体保持健康内稳态离不开细胞的正常代谢运作，细胞代谢本质上就是活细胞内千万种放能反应和吸能反应的总和，而放能反应和吸能反应之间能量传递的纽带就是ATP分子，线粒体是细胞的“能量工厂”，是细胞ATP的主要制造场所，以ATP的形式为内源性反应提供化学能。另外，线粒体还参与多种细胞活动，如增殖、分化、氧化、衰老和凋亡。线粒体形态的变化与其功能密切相关，对细胞命运和组织形成至关重要。在过去的十年中，研究探索了线粒体形态，发现线粒体融合和裂变是一直动态存在的，当细胞处于较优生长条件下时，线粒体的融合率超过裂变率[4,5]，在这种情况下，线粒体可以在代谢活跃的细胞中聚集成管网状结构。线粒体的网络结构与ATP产生增加、活性氧产生减少相关联，而碎片形态与ATP产生减少和线粒体解偶联相关。已经报道了线粒体网络的显微镜观察法和半定量分析法[4,6]。目前，越来越多的证据表明线粒体稳态与皮肤衰老之间存在相关性，为开发新的皮肤抗衰老药物和成分提供了支持。
本研究目的是使用老化皮肤细胞的体外评估模型，通过细胞学、生物化学、免疫细胞化学等手段定量研究由4种活性成分（麒麟竭（Daemonorops draco）、血满草（Sambucus adnata）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、喜马拉雅冰川水）组成的植物复合物——龙血复合物（DBC）对正常人体皮肤细胞ATP水平变化的深层机理、ATP生产工厂——线粒体的功能、线粒体状态对皮肤细胞的影响，以及细胞呼吸过程中其他一些高能化合物对皮肤内稳态的影响。
1、 实验部分
1.1、 主要试剂与仪器
龙血复合物，麒麟竭提取物、血满草提取物、鹰嘴豆种子提取物与喜马拉雅冰川水按照一定的比例组合配制而成；人皮肤成纤维细胞（FB）、人皮肤角质形成细胞（KC），从人皮肤包皮组织（47岁）中提取；DMEM培养基、胎牛血清、Keratinocyte-SFM培养基、Bovine Pituitary Extract(BPE）、0.05%Trypsin-EDTA、F-12培养基、DPBS、ATP试剂盒，美国赛默飞世尔公司；二甲基亚砜（DMSO），国药集团化学试剂有限公司。
无菌操作台、CO2培养箱，美国赛默飞世尔公司；VICTORTM X4酶标仪，美国珀金埃尔默公司；EON型微孔分光光度计，美国伯腾仪器有限公司；Leica SP8激光共聚焦显微镜，德国莱卡公司；Zeiss Scope A1显微镜，卡尔·蔡司股份公司。
1.2 、实验方法
1.2.1、 龙血复合物对人体皮肤细胞毒性的测定
使用来自老化供体的人皮肤成纤维细胞（FB）和人皮肤角质形成细胞（KC），建立衰老细胞的体外评估模型。细胞以5 000 cells/孔接种于96孔板，每孔100μL，贴壁后，换成0.5%龙血复合物培养基，同时设置空白对照组（只添加培养基）。培养48 h后进行MTT实验，每孔加入200μL 0.5 mg/m L MTT溶液，培养3 h，小心吸除上清液，每孔加入100μL DMSO，设置调零组（只加DMSO），轻轻晃动叩击96孔板，待完全融解后，用酶标仪在550 nm处测定其吸光度，计算细胞存活率。
1.2.2、 龙血复合物对细胞内ATP的影响
基于细胞ATP的检测是评估细胞状态的一种较为灵敏的方法[7,8,9]。细胞以5 000 cells/孔接种于96孔板，每孔200μL，培养48 h后换饥饿培养基，18 h后换成0.5%龙血复合物培养基，同时设置空白对照组（只添加培养基），培养48 h后使用Cell Titer-Glo?试剂测量细胞ATP含量。吸出细胞培养上清，加入100μL培养基，设置标准品孔，然后加入100μL Cell Titer-Glo Reagent，轻晃孔板2 min混匀，诱导细胞裂解，室温避光反应10 min，酶标仪读数（Luminescence）。结合ATP标准曲线处理测试数据。
1.2.3 、线粒体形态、网络定量和线粒体融合蛋白-1(Mfn1）的分析
为了揭示龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞ATP促进的作用机制，研究了线粒体的形态和功能，管网状的线粒体网络的形成对于线粒体呼吸、维持其完整性至关重要。应用细胞渗透性Mito Tracker?Red CMXRos探针标记活体成纤维细胞和角质形成细胞中的活性线粒体。染色后，Leica SP8共聚焦显微镜观察细胞的线粒体形态，捕获线粒体的荧光显微镜图像。图像中线粒体网络的半自动分析方法如Valente等[6]所述，将Image J软件和线粒体网络分析工具（Mi NA）结合使用。如图1所示，原始图像（图1A）首先通过阈值处理转换为二值图像（图1B），然后利用“Skeletonize”将二值图像转换为原始图像的骨架化图像（图1C），从而提取细胞线粒体网络的骨架。对骨架进行量化以评估网络结构的丰富程度，每个图像中线粒体网络的数量用细胞数进行归一化。通过这种方式评估龙血复合物对细胞线粒体完整性的影响。
图1线粒体网络Image?J+Mi NA分析（40X),A.?原始图像；B.?二值图像；C.?骨架化图像
Fig.1 Principle of mitochondrial network analysis by Image J+Mi NA (Magnification 40X),A.Raw image;B.Binnary image;C.Skeletonized image
细胞内的线粒体是以连通的网络形式存在的，为了进一步了解线粒体网络形成的机制，研究了线粒体融合蛋白-1 (Mitofusin-1，简称Mfn1）的表达，这种蛋白质是调节线粒体融合和形态的关键分子之一[10]。与它的同源物Mitofusin-2 (Mfn2）仅调节或介导特定细胞类型的线粒体融合的特殊形式不同，Mfn1在人体各种类型的细胞内广泛地表达[11]。Mfn1在培养细胞中的强制表达导致线粒体特征性网络结构的形成[12]。Mfn1定位在线粒体的外膜上，研究表明，敲除Mfn1基因时，线粒体因不能融合而呈现高度碎片化。将培养的成纤维细胞用2%多聚甲醛固定，与抗Mfn1一抗孵育，随后二抗Alexa Fluor?488山羊抗小鼠Ig G孵育，DAPI复染，检测Mfn1的表达。Zeiss Scope A1显微镜拍摄免疫细胞荧光染色图像，比较处理组和未处理组细胞之间Mfn1的差异表达。
1.3 、数据处理
所有数据通过t检验评估统计学显着性。在统计结果中，“*”表示与对照组相比P<0.05，“**”表示与对照组相比P<0.01，“***”表示与对照组相比P<0.001。
2 、结果与讨论
2.1 、龙血复合物对人皮肤细胞的毒性
图2A显示了对照组和龙血复合物处理成纤维细胞的相对细胞活力，图2B显示了对照组和龙血复合物处理角质形成细胞的相对细胞活力。结果表明，用0.5%龙血复合物处理48 h后，与未处理的对照组相比，皮肤细胞显示出轻微但不显着增加的细胞活力。MTT测定结果表明0.5%的龙血复合物对角质形成细胞和成纤维细胞没有细胞毒性作用。
图2A.龙血复合物对老化成纤维细胞的相对细胞活力；B.?龙血复合物对老化角质形成细胞的相对细胞活力
Fig.2 A.Relative cell viability of NT and DBC-treated senescent fibroblasts;B.Relative cell viability of NT and DBC-treated senescent keratinocytes
2.2、 龙血复合物对细胞内ATP的影响
图3A显示了对照组和龙血复合物处理组成纤维细胞ATP的相对含量，图3B显示对照组和龙血复合物处理组角质形成细胞ATP的相对含量。结果表明，当用0.25%龙血复合物处理时，成纤维细胞ATP含量比对照组显着升高了17.7%(P<0.01）。0.10%～0.50%龙血复合物显着提高角质形成细胞中ATP含量（P<0.001）。
图3A.龙血复合物对老化成纤维细胞的相对ATP含量；B.?龙血复合物对老化角质形成细胞的相对ATP含量
Fig.3 A.Relative ATP content of NT and DBC-treated senescent fibroblasts;B.Relative ATP content of NT and DBC-treated senescnet keratinocytes
2.3 、龙血复合物对线粒体形态、网状结构和Mfn1的结果分析
从图4中可以看到，0.25%龙血复合物显着促进角质形成细胞中线粒体网络的形成（P<0.05），与龙血复合物处理的细胞中线粒体网络分支增加结果一致。未经处理的角质形成细胞中，线粒体丰度减少碎片较多。龙血复合物处理的成纤维细胞中，线粒体网络在形态上碎片较少，丰富的分支结构，线粒体网络的总计数与未处理的成纤维细胞中的总计数没有显着差异。
如图5所示，在未处理的细胞中，Mfn1表达微弱，在细胞质中零星分布，而在龙血复合物处理的细胞中，Mfn1更广泛和丰富地表达。这可能解释了龙血复合物对线粒体网络结构的促进作用。
图4MitoTracker??Red?CMXRos染色，A.未处理组角质形成细胞（40X);B.?0.25%龙血复合物处理角质形成细胞（40X);C.龙血复合物对角质形成细胞线粒体网络数的影响；D.未处理组成纤维细胞（40X);E.?0.25%龙血复合物处理成纤维细胞；F.龙血复合物对成纤维细胞线粒体网络数的影响
Fig.4 Mi to Tracker?Red CMXRos staining,A.on non-treated keratinocytes (Magnification 40X);B.on 0.25%DBC-treated keratinocytes(Magnification 40X);C.comparison of mitochondrial network count between NT and DBC-treated keratinocytes (n=3);D.on non-treated fibroblasts (Magnification 40X);E.on 0.25%DBC-treated fibroblasts (Magnification 40X);F.comparison of mitochondrial network count between NT and DBC-treated fibroblasts
图5线粒体融合蛋白-1免疫荧光染色（绿色：线粒体融合蛋白-1；蓝色：细胞核），A.未处理组成纤维细胞（10X);B.龙血复合物处理组成纤维细胞（10X);C.未处理组成纤维细胞（25X);D.龙血复合物处理组成纤维细胞（25X)
Fig.5 Im munocytochemistry staining targeting Mitofusin-1 (Green:Mitofusin-1;Blue:DAPI),A.on non-treated fibroblasts (10X);B.on DBC-treated fibroblasts (10X);C.on non-treated fibroblasts (25X);D.on DBC-treated fibroblasts (25X)
3、 结论
使用从老化供体中提取的正常皮肤细胞建立了体外衰老皮肤细胞模型。利用该模型从细胞中的能量通货ATP和能量工厂线粒体出发，运用细胞生物学、分子生物学、免疫细胞染色、超微影像技术评估了龙血复合物对皮肤细胞状态与细胞能量、线粒体内稳态之间的关系，结果显示龙血复合物通过促进皮肤细胞ATP含量、保持线粒体完整性，增加线粒体网络数、Mfn1更丰富的表达，提示龙血复合物可能通过对皮肤细胞ATP水平变化、线粒体功能有益，起到一定的抗衰老作用，有望成为延缓皮肤衰老、维持皮肤内稳态的化妆品活性物质的使用。本研究中使用的评估方法也可用于筛选与线粒体衰老和生物能量相关的功能活性成分。
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