摘 要： 间充质干细胞(MSCs)因具有低免疫原性，强抗炎及免疫调节作用，成为细胞治疗及再生医学中重要的细胞来源之一。然而，体外培养的MSCs易衰老特性制约着其临床发展与应用。如何延缓MSCs的衰老成为国内外学者研究的热点。本文综述了MSCs衰老相关信号通路及生物活性物质等延缓MSCs衰老的研究进展，以期为MSCs的临床应用提供新的思路。
关键词： 间充质干细胞; 衰老; 延缓; 氧化应激;
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新、多向分化能力和低免疫原性，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和骨髓基质细胞等[1]，不仅存在于骨髓，还分布在脂肪，脐带和牙体等组织[2]。MSCs相对容易获取、分离和增殖，能够较为迅速地达到治疗所需用量;同时，可以调节免疫功能，修复损伤组织，发挥抗纤维化等作用，使其成为细胞治疗领域令人瞩目的供体细胞来源[3]。目前自体或异体MSCs临床试验项目已经获得美国国家食品药物监督管理局批准。然而MSCs作为理想供体细胞的同时，也有越来越多的研究发现其对医学治疗的局限性。其中，细胞衰老是制约MSCs在再生和组织工程中大规模体外扩增应用的主要因素之一。
1、 间充质干细胞衰老的特征
细胞衰老是细胞对各种各样的应激源作出应答后的一种细胞状态，应激源包括基因毒性因子，营养元素缺乏，缺氧，线粒体功能障碍和致癌基因激活等[4]。研究表明，衰老会影响MSCs的功能，包括增殖能力、克隆形成能力、分化潜能、免疫特性、端粒酶活性、细胞迁移能力和粘附性等[5]，突出体现在细胞增殖能力和分化潜能的衰减[6]。文献表明，衰老后MSCs表面特异性标志物CD44、CD90、CD105和Stro-1等表达有所降低[7];细胞形态逐渐扁平肥大，胞膜成分改变，如膜内在蛋白caveolin-1含量上调;胞质pH改变，颗粒固缩;溶酶体间隔增大且活性增加，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)产量升高;溶酶体内脂褐质累积，细胞自体荧光水平上升[8];线粒体较大但功能异常，导致过量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生;同时因核纤层蛋白B1的缺失，胞核完整性遭到破坏，胞质内出现染色质碎片，端粒酶明显缩短[10]等。总之，衰老MSCs最终的结局是停止增殖。
2、 MSCs衰老影响因素
2.1 、氧化应激
2.1.1 、DNA损伤
自由基衰老理论最早提出于1956年，该理论认为衰老是自由基(主要为ROS)对细胞造成不利影响而产生的结果[10]，当机体产生的自由基与抗氧化物的含量失调时的状态被称为氧化应激。随着供体年龄增长或MSCs传代次数增加，机体ROS的不断累积将导致氧化应激的产生。DNA易受到氧或氮氧活性物的氧化损伤，致使DNA甲基化与去甲基化的平衡失调从而导致相关基因的表达抑制或沉默[11]。
2.1.2 、热休克蛋白
蛋白质是ROS信号传导过程中的主要靶标，前者结构被进行可逆或不可逆的修饰，导致细胞生长、分化停滞和死亡。氧化应激反应中有两个比较关键的蛋白参与调控MSCs衰老过程，分别是抗应激性热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)和核因子红细胞2-相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)。HSPs是一种广泛存在于生物体内的保守蛋白，当生物体遭受外界不良刺激时，可发挥分子伴侣的作用。在细胞衰老的过程中，其可保护细胞免受蛋白毒性、细胞凋亡和蛋白质聚集等损害。当ROS诱导相关蛋白质发生错误折叠时，细胞内如Hsp70和Hsp90将作为伴侣蛋白分子，帮助受损蛋白质正确折叠形成特定的功能性结构[12];或是在HSPs的帮助下与泛素连接酶E3结合，发生多聚泛素化后陆续降解;抑或是HSPs通过与受损蛋白结合，将其转运至胞内溶酶体而产生伴侣蛋白介导的自噬作用[13]。热休克蛋白转录因子1(heat shock transcription factor-1,HSF1)在衰老细胞中表达降低，从而逐渐丧失合成HSPs的能力[14]，当机体HSPs表达降低时，许多发生错误折叠的蛋白质无法被识别，导致蛋白质异常聚集而影响其功能发挥。同时，HSPs在维持MSCs干性方面发挥着重要作用，其低表达将使细胞的增殖和分化能力减弱[7]。
2.1.3、 核因子红细胞2-相关因子2
NRF2是氧化应激反应中主要调节因子和转录因子，激活多种抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)依赖基因。NRF2已被证明能在氧化损伤条件下严格控制MSCs的存活[15]。一方面，NRF2可以通过上调参与谷胱甘肽和硫氧还蛋白合成的酶的表达，发挥抗氧化作用而抑制ROS过量产生;另一方面，NRF2相关抗氧化通路也可以减少过量ROS对细胞的损害作用。NRF2/ARE途径是细胞抵御氧化应激损害最为关键的途径之一。基础状态下，NRF2被Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)复合体泛素化，随后被蛋白酶降解。当细胞出现氧化应激反应时，NRF2从Keap1中分离并易位至细胞核，与ARE相互作用，介导相关目的基因转录[16]，强化细胞抵抗ROS毒性的能力。NRF2活性在细胞衰老过程中逐渐下降，MSCs寿命可因其再激活而诱导延长[17]。
2.1.4、线粒体DNA突变
粒体基质含多组线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)，虽然mt DNA的复制与细胞周期进程无关，但氧化产物的积累会导致mt NDA突变，引发线粒体氧化磷酸化功能障碍，最终导致胞核中参与维持线粒体正常功能的基因突变以及人类线粒体相关疾病的发生[18]。
2.2 、端粒酶的作用
研究证明，染色体端粒的缩短和构型改变伴随着体内细胞可复制性衰老的进程[19]。Baxter等[20]认为，成年人细胞端粒每年以17 bp缩短，当h MSCs的端粒长度达到10 kb时，细胞将停止分裂。而端粒酶缩短触发细胞衰老的过程可能与端粒重复结合因子2(telomeric repeat-binding factor 2,TRF2)的缺失有关，导致DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)相关蛋白被激活和募集。TRF2作为一种功能蛋白，通过识别特定的多肽序列维持端粒酶的稳定性。Wu等[21]选择性地敲除小鼠3'端外结合蛋白Pot1a，最终导致端粒酶区域的相应DDR并且诱发衰老。简单来说，当某些端粒的长度迅速缩减，细胞将进入生长停滞状态，此时通常触发DNA损伤和影响细胞衰老状态[22]。
3 、MSCs衰老相关信号通路
3.1 、核因子κB
核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是转录因子家族的一员，不仅在细胞生长、增殖和生存方面发挥重要作用，其相关信号通路也参与调节ROS水平。不断增加的ROS在激活NF-κB信号通路的同时，NF-κB下游靶基因通过增加抗氧化蛋白的合成，如锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)、铁蛋白重链、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)-1和金属硫蛋白3等，降低ROS水平，延缓衰老[23]。
3.2 、沉默信息调节因子1
干细胞的代谢作用可以影响ROS水平，同时ROS也可以通过与多种蛋白质相互作用，例如激酶、磷酸酶或转录因子等影响代谢途径，从而调控细胞周期、控制细胞的分化及凋亡等[24]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是Sirtuins家族(Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶)成员之一，作为一种转录调节因子参与并控制代谢信号的转录因子去乙酰化作用来调节其活性。SIRT1可以通过去乙酰化作用调控HSF1[25]，减轻ROS造成的细胞伤害。在H2O2诱导人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)衰老中发现，SIRT1可以与衰老细胞中高表达的p53结合，通过去乙酰化和泛素化作用对其进行降解，抑制p53水平，减轻氧化应激对细胞衰老的影响[26]。
3.3、 脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶通路
研究发现，低氧时人牙髓干细胞氧化应激相关磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(protein kinase B,AKT)通路的关键蛋白表达升高;加入抑制剂LY294002后胞内ROS释放和凋亡细胞的比例明显增加，GPX表达降低，细胞增殖能力减弱;激活的PI3K/AKT逆向调节下游蛋白叉头转录因子1(forkhead box O1,FOXO1)和caspase3表达来影响细胞内ROS产生，证明低氧条件下PI3K/AKT途径的激活可以有效抑制ROS的产生，从而调节细胞氧化应激状态[27]。Nan等[28]发现，髓核来源的间充质干细胞在H2O2诱导的氧化应激状态下，细胞增殖速率降低，凋亡增加，PI3K和磷酸化AKT蛋白表达明显降低。在相似实验条件下，大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)胞内ROS含量和凋亡细胞数量明显增高，FoxO1、FoxO3和FoxO4基因表达下降;而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理后发现，NAC可激活PI3K/AKT信号通路抑制胞内ROS的产生，上调FoxO1、FoxO3和FoxO4基因表达，保护BMSCs免受氧化应激的损害[29]。
3.4 、p53基因
p53是人体抑癌基因，研究证明p53也参与调节细胞衰老进程[30]。其中p53-p21-p16相关信号通路激活可加速细胞周期阻滞。但也有研究认为，p53激活在增加ROS的同时也促进了许多抗氧化基因的表达，发挥促进和抑制细胞衰老的双重作用[31]，猜测p53可能通过不同途径控制细胞生长和代谢，包括调节ROS水平和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)活性。m TOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节细胞生长、蛋白质合成等，并且与特定类型的衰老诱导密切相关[32]。p53下调m TOR水平，且p53通路合成蛋白来预防并修复氧化应激所致的DNA损伤[33]，减缓细胞衰老。
3.5、 p38/丝裂原活化蛋白激酶通路
ROS增高，p38/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路被激活。Jim等[34]发现，番茄红素可提高H2O2诱导的衰老hMSCs的生存能力，降低ROS水平;胞内p38 MAPK表达上调，同时Mn SOD浓度增加，提示番茄红素通过p38 MAPK和PI3K/AKT信号通路共同调节ROS水平。Jin等[35]发现衰老的人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)，衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的主要成分单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)浓度升高，通过其同源受体趋化因子受体2增加ROS的浓度，在激活p38 MAPK-p53/p21通路后，正反馈进一步提高MCP-1的分泌，加速细胞衰老进程。
4 、延缓MSCs衰老的相关研究与进展
MSCs体外培养易衰老特性使MSCs扩增数量受限，从而限制其在临床的应用。如何使衰老的MSCs再现年轻化状态而延长其利用价值成为再生医学的研究热点之一。Romanov等[36]率先利用人乳腺上皮细胞探索细胞衰老状态是否可以被逆转。此后，越来越多的学者尝试通过添加生物活性物质或药物等方法延缓MSCs衰老进程。
4.1、 生物活性物质
4.1.1、 细胞因子
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)-2通过抑制复制性衰老的hMSCs中p16Ink4a、p21Cip1和p53 m RNA表达，减少了衰老细胞的百分比;并推测FGF-2通过下调转化生长因子β2表达抑制hMSCs衰老[37]。衰老细胞的SASP与Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)有着密切联系，而TLRs在MSCs中积极表达，参与细胞增殖、分化、迁移和免疫等活动。β型干扰素(interferon-β，INF-β)与受体结合可以激活Janu激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transduction and transcriptional activator,JAK/STAT)信号通路，参与细胞衰老，提示可以通过调节MSCs内INF-β表达控制衰老进程[38]。Wen等[39]证明巨噬细胞迁移抑制因子预处理阿霉素诱导的衰老MSCs，通过激活PI3K/AKT信号通路减少ROS生成，改善衰老细胞的增殖速率、端粒酶长度和活性以及旁分泌功能等，对以阿霉素治疗为主的癌症患者可能具有重要的临床治疗意义。有研究认为，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)与IGF结合蛋白(IGF-binding proteins,IGFBP)4/7的结合，是诱发MSCs衰老的关键，抑制IGFBP4/7生成，降低细胞凋亡，促进细胞增殖[40]。
4.1.2 、细胞旁分泌物
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌的一种质膜纳米小泡，主要包括凋亡小体(apoptosis body)、微囊泡(microvesicles,MVs)和外泌体(exosome)。EVs不仅携带母体特征，还可以通过靶向传递参与机体多项生理活动，发挥生物学功能[41]。雷倩等[42]用衰老BMSCs与UCMSCs来源的MVs共培养，发现UCMSCs-MVs可以增强衰老BMSCs的成骨能力和促新血管生成能力，同时抑制其脂肪分化能力。也有研究发现UCMSCs来源的外泌体，可以下调老年人来源的MSCs p53、p21和p16的表达，增强SIRT1活性，改善MSCs的衰老表型[43]。这些研究说明EVs在参与细胞衰老的进程中可以发挥积极作用。Sarah等[44]发现，人血小板裂解液培养的h MSCs细胞形态较对照组明显减小，细胞增殖速率加快且β-Gal表达减少，衰老MSCs得以呈现年轻化表型。
4.1.3 、其他
褪黑素(melatonin,Mel)具有清除ROS和诱导抗氧化反应的作用[45]。Mel处理衰老犬ADSCs后，其SASP相关基因和蛋白水平显着高于对照组年轻细胞，并推测可能与Mel通过受体MT1/MT2抑制犬ADSCs中SASP和NF-κB信号通路表达相关[46]。核纤层蛋白A也被称为早衰蛋白，金属蛋白酶Zmpste24调控其活性。在Zmpste24缺失诱导的早衰模型中，Baohua等[47]通过添加一定量的白藜芦醇(Sirt1激活剂)，使早衰BMSCs增殖效率提高，同时体内实验证明可以延长早衰小鼠的寿命。Mengkai等[48]发现，常见抗氧化剂抗坏血酸可通过AKT/m TOR信号通路减少衰老MSCs中ROS的产生，从而预防MSCs进一步衰老，为临床干细胞移植提供更多的可能性。有趣的是，Fulvia等[49]发现低浓度异硫氰酸盐(isothiocyanates,ITC)处理衰老MSCs时，其氧化应激反应降低;而高浓度TIC处理后，MSCs遭受来自氧化应激的细胞毒性作用，进一步导致DNA损伤。
4.2 、药物
溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acids,LPA)是膜磷脂合成中的一种代谢产物，研究表明LPA参与并维持机体的正常生理功能。MSCs优先表达LPA受体亚型1，通过添加该受体拮抗物Ki16425，细胞衰老相关的p16Ink4a、Rb、p53和p21Cip1在hBMSCs中的表达均受到抑制，明显减缓了体外连续培养的hBMSCs衰老状态[50]。生物活性分子载体丝蛋白与姜黄素结合可延缓BMSCs衰老进程，且延缓程度与姜黄素剂量和刺激时间有一定关系，但具体机制还有待进一步探究[51]。
雷帕霉素(rapamycin,RAPA)是一种m TOR抑制剂，已被证实具有延缓细胞衰老的作用，机制可能是通过对AKT/m TOR的抑制作用从而调节胞内ROS的产生，多能性基因Nanog和Oct-4的表达及DNA损伤累积而产生相应效应[52]。曹玉林等[53]研究发现复制性衰老的UCMSCs经RAPA处理后，细胞体积变小，β-gal染色阳性细胞减少，p53表达降低，血管相关形成因子表达增高;小鼠体内实验表明RAPA治疗组较对照组能增强缺血区域血管新生，证明RAPA可以成为延缓MSCs衰老状态的新手段。曾毅等[54]利用Ku0063794和RAPA作用于衰老的BMSCs，也得到了同样的结果。RAPA还可以通过抑制m TOR信号通路，明显改善来自系统性红斑狼疮患者的BMSCs的衰老表型和免疫调节功能，为治愈此类疾病带来新的希望[55]。
从川芎嗪中提取的生物碱———川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)处理衰老BMSCs后，其衰老表型得到明显改善。研究证实，衰老细胞可以分泌大量肿瘤坏死因子(tumor necrosis fator,TNF)-α和白细胞介素(interlukin,IL)-1β等，而这些细胞因子通过与各自的受体结合激活了下游NF-κB信号通路，推测TMP可能通过抑制TNF-α和IL-1β的分泌使NF-κB信号通路失活，从而减缓细胞衰老[56]。
4.3 、其他
Frobel等[57]将MSCs重编为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs),i PSCs的甲基化保持了供体特异性，但与衰老及年龄相关的DNA甲基化形式在重编过程中已被清除。结果显示i PS-MSCs在培养扩增过程中仍会出现与衰老相关的DNA甲基化，但在与年龄相关的DNA甲基化方面，仍保持年轻化状态。也有研究通过成功建立稳定的FOXQ1慢病毒表达系统，证明FOXQ1过表达组衰老细胞增殖能力明显强于对照组，且前者衰老相关β-gal表达量低于对照组[58]，说明FOXQ1对UCMSCs起到一定程度的抗衰老作用。Erb-B2受体酪氨酸激酶4(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 4,ERBB4)可以调控缺氧条件下MSCs的活性，Liang等[59]通过建立体外与体内ERBB4过表达实验证明，ERBB4的过表达可以改善MSCs衰老表型，并通过PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路增强了促血管生成的潜力。Bmi1缺乏症会抑制BMSCs的增殖和成骨分化，导致机体出现过早衰老和骨质疏松症。Chen等[60]发现，Bmi1过表达通过失活p16/p19信号通路减弱氧化应激反应，发挥抗衰老和抗骨质疏松作用。
5、 结语
MSCs因殖能力强，多向分化潜能，来源广泛和非致瘤性等特性，成为再生医学中较为理想的细胞来源。但是MSCs在体外培养过程中，不可避免地发生复制性衰老，或因外界多种因素影响使细胞产生氧化应激状态而提前早衰，从而导致MSCs自身功能障碍，严重制约其在组织工程医学及临床的应用。因此，越来越多的研究关注如何更好解决MSCs衰老这一棘手问题。学者们利用体外及动物体内实验对衰老机制进行探索，致力于探寻一种可以延缓甚至逆转细胞衰老状态的有效途径。关于MSCs的衰老机制尚未完全阐释，体外已被逆转衰老状态的细胞被应用于体内后，其安全性及有效性仍待验证，但是随着研究的逐步深入，衰老MSCs终将重现年轻化状态而更好地应用于临床医学。
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