摘 要： 在真核生物中，细胞可以通过自噬(autophagy)和外泌体(exosome)的分泌两种方式来对外界刺激做出应答从而维持细胞内稳态。自噬是溶酶体依赖性细胞组分降解的过程，其能被氧化应激、饥饿或蛋白质聚集等因素诱导发生。除了自噬途径，细胞还可以通过分泌外泌体来调节细胞的生命活动，新的研究表明自噬与外泌体发生有同样的分子机理。本文综述了自噬与外泌体发生的过程以及两者之间的联系。
关键词： 自噬; 外泌体; 内涵体; 自噬内涵体; 溶酶体;
Abstract： Eukaryote cells can respond to extracellular stimuli via autophagy and exosome secretion to maintain intracellular homeostasis. Autophagy is a process of intracellular components degradation via lysosomal-dependent pathway, which can be induced by oxidative stress, starvation and protein aggregation. In addition to autophagy, cells can regulate cellular metabolism by secreting exosomes. Recent studies show that autophagy share common molecular mechanism with exosome biogenesis. This review summarized the processes of autophagy and exosome biogenesis, and the interaction between them.
Keyword： autophagy; exosome; endosome; amphisome; lysosome;
内膜系统是指在结构、功能，甚至生物发生方面彼此相关的、由单层膜包被的细胞器或细胞结构，主要包括内质网(endoplasmic reticulum,ER)、高尔基体、溶酶体、内涵体和分泌囊泡。该系统参与了许多细胞生命活动，如胞吞作用、胞吐作用和信号转导。这些脂质膜在结构和功能上相关联，其形式多样，彼此融合或分离，不断更新膜的组分。
自噬与外泌体在细胞代谢中起着重要的作用。自噬是真核细胞中广泛存在的细胞内降解途径，自噬小体中含有蛋白质、受损的细胞器和侵入性病原体等，内容物会被转运至溶酶体并被溶酶体酸性水解酶降解。降解产物被释放到细胞质中循环利用，以满足细胞自身代谢的需求或使某些细胞器得到更新[1]。外泌体发生则是囊泡形成和释放的过程，从胞吞作用到内涵体的形成，再通过与质膜融合释放到胞外环境[2]。它们的携带成分复杂，有蛋白质、脂质、核酸等，常参与细胞之间组分或信号的交流。自噬内涵体(amphisome)是一中间产物，是自噬与外泌体发生的连接点，两条途径共享这一中间细胞器，探索其间的相互作用关系显得尤为重要。其相互作用关系有望成为疾病诊断和治疗的新靶点，或者作为临床治疗药物的天然载体。因此，充分了解自噬途径与外泌体发生对改善人类健康有着非常重要的意义。
1 、自噬概述
自噬是广泛存在于几乎所有真核生物中的一种降解机制。在细胞质中，一些大分子或细胞器被双层膜包裹形成囊泡，被称为自噬体。包被膜起始由粗面ER[3]上无核糖体附着区域脱落，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，使内容物降解，以维持细胞正常的生命活动[4]。当细胞面临饥饿、缺氧或生长因子缺乏时，细胞可以通过自噬循环利用糖、脂质和氨基酸来促进细胞存活[5]。自噬可以分为三种类型：微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。微自噬通过直接的溶酶体膜内陷促使蛋白质降解；巨自噬(本文中所说的自噬)是自噬的一种，这归因于其易于区分的形态学特征；CMA直接通过溶酶体膜转运靶蛋白进行降解，其显着特征是底物转运至溶酶体不涉及囊泡和膜内陷[6]。
1.1 、自噬的机理与调节过程
Glick等[7]提出自噬是一种“自我吞噬”过程，是多余或异常细胞成分的降解途径之一。他们发现在注射胰高血糖素的大鼠肝脏细胞中，线粒体和细胞质中其他组分可以在溶酶体中降解。现今，在真核生物的进化中，30多个高度保守同源的自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)已经被鉴定，它们参与了自噬的一系列过程[8]。
自噬可以由营养缺乏、生长因子缺乏或活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)诱发，这是蛋白质和细胞器(包括ER、线粒体、细胞核和核糖体)更新和再循环的主要途径[9]。因此，自噬可以看作是细胞的“回收工厂”，通过ATP的生成和营养物质的循环来提高能量利用率，从而促进细胞的存活[10]。自噬体是由ER和/或内涵体的脂质双分子层起始发生，而后成核并延伸[11]。在哺乳动物中，自噬体的具体装配起始位点(assembly site of phagophore,PAS)仍有待研究[12]。营养缺乏是自噬最常见的关键调节因素，其通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路进行调节。自噬起始UNC51样激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)是哺乳动物中ATG1的同源物，而ATG1对成熟网织红细胞的自噬非常重要。当ULK1被磷酸化或富余的营养与生长因子促使mTOR复合体1(mTOR complex 1,mTORC1)抑制ULK1活性时，则会抑制自噬[13]。ULK复合物由ULK1(或ULK2)、ATG13、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)家族相互作用蛋白FIP200(FAK family interacting protein of 200k Da)和ATG101构成[14]。起始新生的自噬体成核是由募集III类肌醇磷脂-3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)复合物开始的，之后PI3K复合物被组装到囊泡蛋白分选34(vacuolar protein sorting 34,VPS34)及其偶联亚基VPS15、ATG14L和Beclin-1上[15]。细胞中有两种泛素样结合系统(ATG5-ATG12和ATG7-ATG3复合物)能够在自噬体膜的延伸中使ATG8与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)共价结合[16]。随后，成形的自噬体与溶酶体融合，最终形成自噬溶酶体，其中组分被酸性水解酶水解，从而使物质得以循环利用[17]。
1.2、 分泌型自噬
与常规的自噬相比，自噬途径涉及到细胞质成分分泌的，被称为分泌型自噬，这与从ER到高尔基复合体再到质膜的普通分泌途径不同[18]。如细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是一种哺乳动物细胞促炎症细胞因子，其前体在细胞质中缺乏氨基酸信号序列，可以被炎性小体激活[19]。当IL-1β分泌时，它与自噬体相互作用，被与R-SNARE Sec22b相互作用的特异性受体TRIM16识别，随后被转运到LC3-II+膜中，IL-1β位于双膜结构的膜间隙，最终与质膜融合得到释放[20]。其中功能性多泡体(multivesicular bodies,MVBs)对于自噬依赖性的IL-1β分泌是必需的。这一过程被称为分泌自噬，是由Ponpuak等[18]首次观察发现到的。总的来说，自噬在调节常规和非常规的物质分泌中起着重要作用，在执行细胞功能以及参与细胞之间的通信中扮演着重要角色。
2、 外泌体
外泌体是纳米级小囊泡，它可以将核酸和蛋白质等物质转运至受体细胞。几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，可以在体液中检测到。细胞通过外泌体可以去除细胞内有害物质或将细胞信息传递给其他细胞[21]。来源于质膜或高尔基体的小泡可以与早期内涵体融合，然后开始分选并转运至细胞外基质[22]。期间，早期内涵体经历一系列的生理过程，包括内陷、出芽和积聚管腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)，最后成熟形成晚期内涵体，也称为MVB[23]，最终与溶酶体融合。然而，MVB还能够与质膜融合将ILVs释放到细胞外环境，从而产生外泌体。“外泌体”一词是由Rose Johnston在1987年提出来的[24,25]。另外，MVB还可以与自噬小体相互作用形成中间产物，称为自噬内涵体，最终与溶酶体融合[26]。
外泌体是细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)之一，EV是在进化上保守的、细胞分泌的大家族膜包被小泡，包括凋亡小体(直径大小为500 nm～2μm)、微泡(100 nm～1μm)、外泌体(30 nm～150 nm)甚至更小的囊泡，如微泡体(ectosome)[27,28]。真正的外泌体除了对直径的要求外，还要有富含一系列通常来自内涵体的分子标记[28]，如CD63、CD81、CD9、TSG101和syntenin-1[29]。有趣的是，在其它EV中也发现有典型的外泌体标记物。如100 K pellet富含四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)，但是CD63和CD9也存在于2 K pellet和10 K pellet中[29]。
2.1 、外泌体的发生
外泌体的发生涉及内涵体通路和胞吞作用。细胞通过胞吞作用形成吞噬泡，其可以与早期内涵体融合，随后该杂合体逐渐成熟形成晚期内涵体[30]。在这个过程中，分选工作已经开始，内涵体膜向内出芽并断裂，在内部空腔内产生各种ILVs[31]。在外泌体分子组成数据库中了解到[32]：外泌体转运需要有MVB相关蛋白、内涵体分选转运复合体(endosomal sorting complexes required for transport,ESCRT)或CD63参与[33]。ESCRT包含大约30种蛋白质，这些蛋白质组装成四种不同亚型的复合物(ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-I I I)和从酵母到哺乳动物保守的相关复合物(VPS4、VTA1、ALIX)[34]。ESCRT机制参与决定外泌体的大小、数量和蛋白质组成，还调控神经酰胺参与MVB的形成[35,36]或四次跨膜蛋白(四个跨膜结构域参与MVB形成时组分的募集)CD81、CD9和CD63的募集[37]。
2.2 、将“货物”装入外泌体
外泌体的组分包含蛋白质、脂质和核酸(如DNA、mRNA和一些小非编码RNA等)，被认为是非常规的分泌途径[26]。外泌体内部组分的构成主要取决于细胞的类型，并且还会受到细胞微环境或药物处理的影响。因此，不同来源的外泌体之间的内容物是有差异的，具体机制仍有待探索[38]。Syntenin在进化上保守的晚期结构域(late domain,L-domain)可以帮助蛋白质进入外泌体。L-domain蛋白是Nedd4家族相互作用蛋白1(Nedd4 family-interacting protein 1,Ndfip1)，该蛋白质通过主动转运进入由转染细胞和原代神经元分泌的外泌体中。Ndfip1的表达可以促进三种蛋白质(Nedd4、Nedd4-2和Itch)在外泌体中聚集，但它们不存在于外泌体中[39]。蛋白质进入外泌体的途径很多，其中大多数机制仍然不是很清楚。核酸可以通过MVB中的RNA结合蛋白或脂筏相互作用装载到外泌体中；细胞RNA持续地与MVB的细胞质面相互作用，RNA特异性地被募集到ILV中，这主要取决于RNA与MVB膜外层筏状结构域的关系[40]。外泌体中包含多种RNA，如lnc RNA、mRNA、circRNA和miRNA[41]。此外，外泌体可以保护RNAs免受RNA酶的破坏[42]。因此，外泌体是科学实验中重要的媒介物。在膜的微环境中大量的四次跨膜蛋白可以帮助蛋白质和核酸装载到外泌体中[43]。RNA靶向进入外泌体涉及高效的分选机制，其允许一些特异的RNA被装载到外泌体中，而其他RNA在外泌体中几乎检测不到。另外，脂质可能在选择特异性蛋白质进入外泌体中起重要作用。已观察到，相较于其亲代细胞，外泌体具有大量的鞘糖脂、胆固醇和鞘磷脂[44]。事实上，脂质在外泌体分泌中的作用研究表明，lyn、fotillin-1和stomatin通过与外泌体膜中脂质结构域的相互作用而分泌到胞外空间[45]。有趣的是，在哺乳动物中还有一种特殊机制——外泌体利用HSC70与MVB膜的静电作用，将蛋白质转运至外泌体中[46]。
2.3 、外泌体的去向
MVB有三种不同的命运。当MVB与质膜融合时，ILV作为外泌体分泌到细胞外空间。最近提出的泛素样修饰(ISGylation)是MVB命运的调节机制之一，它是一种翻译后泛素样修饰[47]。MVB蛋白的泛素样修饰致使MVB与溶酶体融合，介导MVB降解而不是进入分泌途径[47]。此外，肌动蛋白和微管细胞骨架在MVB向质膜的转运中起着重要作用[38]。外泌体不仅可以作用于周围受体细胞，也可以作用于自身母细胞。外泌体可以在细胞表面富集，因为它们通过tetherin(一种能使病毒紧系在细胞上的蛋白)黏附于质膜。因此，在HeLa细胞中，抑制囊泡ATP酶可导致外泌体分泌大幅提升[48]。通常，外泌体的特征在于黏附蛋白的表达，包括整联蛋白家族。外泌体整联蛋白被驻留细胞摄取，激活Src磷酸化和促炎S100基因表达，这可用于预测特定器官的癌转移[49]。B细胞来源的外泌体含有整联蛋白，锚定于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞表面的黏附分子，这可能不是细胞和细胞之间的直接通信，而是通过黏附传导信号的方式实现的[50]。
如果外泌体膜中含有CD47，这意味着外泌体将免受巨噬细胞和单核细胞的吞噬[51]。外泌体在细胞内的运输和外泌体与细胞的相互作用很大程度上取决于吞噬作用。外泌体的摄取依赖于细胞骨架和PI3K，而敲低dynamin2将抑制外泌体的摄取[52]。来自癌细胞的EV具有外泌体样特征，其与细胞表面摄取受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)相互作用，介导外泌体的摄取和功能活性[53]。当外泌体被巨噬细胞吞噬时，不会产生炎症反应[54]。外泌体在丝状伪足上聚集，随着伪足的伸缩运动，被募集进入受体细胞。这些外泌体基于伪足和内涵体内转运，最终靶向转运至ER[55]。EV进入细胞不仅通过一种内吞途径，还可通过网格蛋白依赖的胞吞作用和网格蛋白非依赖性途径。后者包括窖蛋白介导的摄取、大胞饮、吞噬作用和脂筏介导的摄取[56]。然而，由于过程的复杂性，深度探索外泌体的靶向运输和摄取机制是一场重大挑战。
2.4 、外泌体的发生涉及自噬相关蛋白
新的证据表明，自噬与外泌体发生之间存在共有的分子机制或细胞器。如ATG5和ATG16L1在外泌体的生物发生中发挥着重要作用。缺失ATG5和ATG16L1会抑制外泌体的发生并在很大程度上降低脂化的LC3B在外泌体中的含量。ATG5通过解离晚期内涵体膜上的质子泵(V1Vo-ATPase)来降低M V B的酸化程度，这是由于调节成分ATP6V1E1从V1Vo-ATPase上脱离下来进入到外泌体中[57]，促进MVB与质膜融合，随后释放外泌体。已有报道在内涵体和吞噬体中检测到ATG5-ATG12和ATG16L1复合物以及LC3。这些自噬相关蛋白质潜在的功能是确保囊泡的酸化并在溶酶体中降解[58]。ATG7的存在对ATG12-ATG3复合物的形成和促进外泌体释放是必要的[59]。但是，先前有报道称ATG7对外泌体释放没有影响[46]。ATG5对于调节外泌体发生是非常重要的，但和ATG7不同，ATG5既不影响培养基中的外泌体摄取，也不参与MVB腔内囊泡出芽[57]。此外，在ATG5敲除细胞中，当用巴佛洛霉素(bafilomycin)或V1VoATPase抑制剂处理细胞时，检测到外泌体的释放水平提高，这表明MVB是进入溶酶体降解途径还是发生质膜融合是由囊泡内的pH环境决定的[60]。ATG5复合物与LC3相互作用并使LC3脂化产生LC3-II。因此，与LC3-I相比，外泌体中富含更多脂质修饰的LC3-II[57]。然而，我们仍不清楚在ILV内侧的LC3B的生物学功能。
泛素样分子ATG12靶向结合ATG3形成ATG12-ATG3复合物，其通过与ESCRT相关蛋白Alix(也称为PDCD6IP)的相互作用来调控外泌体发生。Alix作为ESCRT复合体的一个组成部分，可调节许多膜通讯，如ILV形成[61]、外泌体释放[62]和病毒出芽[63]。此外，Alix与cortactin相互作用，参与细胞骨架的重塑[64]。ATG12-ATG3调节各种Alix依赖过程，如外泌体发生和MVB的命运(形态、分布和功能)[59]。ATG12-ATG3不足会减少基本自噬通量，致使核周围MVB的累积，这抑制了晚期内涵体向溶酶体的运输、减少了外泌体的产生。Alix的缺乏明显阻碍了基本自噬，但不会影响饥饿诱导的自噬，这表明在正常情况下基本自噬和应激诱导的自噬之间存在明显不同的调节机制。类似于ATG12-ATG3和Alix，组蛋白去乙酰化酶HDAC6对于基本自噬途径是必不可少的，但对于饥饿诱导的自噬是无关紧要的。跨膜蛋白ATG9参与自噬过程，发现其也与ILV的形成相关。敲除ATG9降低了自噬通量以及自噬体的数量和大小，并改变了自噬内涵体或自噬溶酶体的形态[65]。
3、 自噬内涵体
自噬内涵体是一种前溶酶体杂交小泡，认为是细胞中的降解区和新型分泌型细胞器。早期自噬体可以与MVB融合，形成称为自噬内涵体的杂交小泡，其下游去向是与溶酶体融合，对内含物进行降解。有证据表明，大鼠肝脏中的自噬内涵体富含早期内涵体标记物(如early endosome antigen 1,EEA1)和晚期内涵体标记物甘露糖-6-磷酸受体，表明自噬内涵体成分可能源于早期和晚期内涵体[66]。在饥饿或雷帕霉素诱发的自噬中，GFP-Rab11(MVB的标记物)标记的小泡会延伸，且与LC3(自噬体的标记物)有明显的共定位。Rab11的功能结构域是MVB与自噬体之间异型融合所必需的，但其不参与自噬体的同型融合。此外，钙螯合剂可以阻碍内涵体与自噬途径之间的相互作用，说明MVB与自噬体是钙依赖性融合。自噬内涵体是不含有溶酶体标记物的，其腔内p H值低，表明存在跨膜质子泵。
ISGylation是外泌体分泌过程中初始的泛素样修饰者。在哺乳动物细胞系和小鼠模型中泛素样蛋白ISG15致使MVB与溶酶体融合，促进MVB蛋白的募集和降解。因此，通过泛素样修饰，MVB蛋白TSG101(ESCRT-1辅助蛋白)将被募集并降解，外泌体的分泌数量也随之减少[47]。使用bafilomycin A1抑制自噬途径可以阻止内涵体与溶酶体的融合，从而有利于外泌体释放，这表明自噬参与了泛素样修饰的MVB聚集体的降解。
研究表明，CD63是初级病毒癌蛋白潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)装载到外泌体或其它EV中所必需的。CD63依赖性囊泡蛋白的分泌抑制胞内下游LMP1信号激活。在CD63敲除的细胞中，抑制自噬途径可恢复带有LMP1的外泌体少量分泌，并通过病毒蛋白减弱信号转导[67]。CD63在内涵体与自噬过程之间的交联和细胞信号通路中起重要作用。近年来发现，自噬内涵体也可以与质膜融合，然后释放囊泡至胞外空间，而不是走溶酶体降解途径。例如，在肺上皮细胞中，干扰素-γ(IFN-γ)诱发的自噬对于分泌含有膜联蛋白A2(ANXA2)的外泌体至关重要[68]。研究表明，IFN-γ处理后含有ANXA2的自噬体与MVB融合随后释放外泌体，这依赖于ATG5、RAB11、RAB27A和RAB8A[68]。RAB8A是自噬依赖性IL-1β分泌的媒介物。
4 、总结
适度自噬有利于细胞存活，因为它具有降解有害内容物的能力，并有助于在困境中循环能量和构建细胞。外泌体释放可能与信号传导和应激应答有关。自噬和外泌体的生物发生在维持细胞适应性方面发挥着重要作用。细胞可以通过外泌体或自噬溶酶体途径清除有害蛋白质或受损细胞器，这两种途径相辅相成。如自噬相关蛋白和蛋白质复合物参与外泌体的生物发生。而自噬内涵体是外泌体和自噬途径的联系点。自噬内涵体不仅可以与溶酶体融合，而且能与质膜融合以释放内容物。然而，自噬内涵体的具体去向机制仍有待进一步研究，自噬内涵体可能有特定的信号决定了其命运。细胞通过自噬和外泌体之间的联系对应激作出应答，进一步的研究对于理解这些过程之间的潜在关系是非常必要的。如果我们能更好地熟悉它们的调节机制，自噬和外泌体将作为一种前瞻性治疗策略。在某种程度上，我们可以利用外泌体来运输治疗药物以避免水解酶的降解。真核内膜系统极其复杂，我们还需要对其进行更深入的研究。
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