泛素化修饰与身体调控及疾病的关系(2)

　　当配体诱导EGFR激活后，  EGFR很快发生泛素化，起 作 用 的E3连 接 酶 主 要 是Cbl（Cas-Br-Mecotropic  retroviral  transforming  sequence）RING-类型E3泛素连接酶[31],  Cbl可直接被招募到激活的EGFR胞内段的磷酸酪氨酸残基（Tyr1045-P）处，也可间接被 接 头 蛋 白GRB2（growth  factor  receptor-boundprotein  2）募集到胞膜处促进激活的EGFR泛素化[32].EGFR被泛素化修饰的方式主要是单泛素化修饰及K63多聚泛素化修饰，并且配体的浓度与泛素化的程度可影响EGFR内化的路径。例如，当EGF处于低浓度时， EGFR的泛素化程度难以被检测到，此时EGFR主要进行由网格蛋白（Clathrin）介导的内化。而当EGF处于高浓度时，大量EGFR处于泛素化状态，此时EGFR主要发生的Clathrin非依赖但脂质筏依赖的内化[33].内化方式的不同也决定了EGFR的命运与信号通路的持续时间，当EGFR进行由网格蛋白介导的内化时，  EGFR并不进入溶酶体反而被重循环到胞膜上，从而延长并增强了EGFR信号通路，反之进行网格蛋白非依赖的EGFR更容易被运送到溶酶体执行降解[34].然而，有些研究表明，即便EGF处于低浓度，  EGFR的泛素化也可被检测并能促进EGFR进入网格蛋白小窝[35].尽管泛素化对EGFR的具体调控机制与作用未彻底阐明，但几乎所有的实验数据都表明泛素化可影响EGFR的内化程度，内化路径而调控EGFR的命运，从而改变整条EGFR信号通路。
　　
　　1.3泛素化修饰与DNA损伤修复
　　
　　面对频繁的外部的（如紫外辐射与化学致癌剂）和内部的（如活性氧）各种损伤因子，基因组不可避免会出现损伤，因此及时的DNA损伤修复对保持基因组完整性是必需的[36].为此真核生物主要发展出了5条DNA修 复 通 路，这 包 括 核 苷 酸 切 除 修 复（nucleotide excision repair, NER）、碱基切除修复（baseexcision  repair,  BER）、错配修复（mismatch  repair,MMR）、同源重组（homologous  recombination,  HR）以及 非 同 源 末 端 连 接（non-homologous  end  joining,NHEJ）修复。近年来的研究又提示存在着一条DNA复制压力通路的修复机制，被称为跨损伤DNA合成（translesion DNA synthesis, TLS）[37].现有研究发现相当一部分DNA修复蛋白存在着极为动态的泛素化修饰，并与上述DNA修复通路功能状态紧密相关，尤其引人注意的是DNA修复蛋白的单泛素化修饰存在与否对同源重组途径及跨损伤修复途径产生的巨大影响[38].
　　
　　当DNA发生交联时，一系列蛋白质协作通过HR及TLS通路修复DNA以维持基因组稳定性。如果基因发生突变破坏了此类蛋白质的正常功能就会导致一种被称作范科尼贫血（Fanconi  anemia,  FA）的临床综合征，病人染色体不稳定性增加并更容易罹患白血病与鳞状细胞癌[39].
　　
　　有趣的是，其中一种FA蛋白，范可尼贫血互补群D2（Fanconi  anemia  complementation  group  D2,FANCD2），在处于各种DNA损伤条件下时可特异性地在第561位赖氨酸上被单泛素化修饰。单泛素化修饰的FANCD2被募集到染色体相关核灶处，并与乳腺 癌 抑 制 蛋 白 及 卵 巢 癌 抑 制 蛋 白BRCA1（breastcancer  1）和BRCA2以及其他DNA修复蛋白相互作用[40].将FANCD2上第561位赖氨酸突变为精氨酸可 破 坏FANCD2的 单 泛 素 化 修 饰，从 而 破 坏FANCD2与其他一系列DNA修复蛋白的相互作用进而导致DNA修复失败，并且研究者已在许多FA病人来源的细胞中发现此现象。更有意思的是，  FA病人中存在各种互不相同但都能破坏FANCD2单泛素化修饰的突变，这提示有许多FA蛋白协作于一条公共通路来调控FANCD2的单泛素化修饰[41].
　　
　　1.4泛素化修饰与细胞凋亡
　　
　　对凋亡的正确时空调控对多细胞生物的生存至关重要。过强的凋亡可促进神经退行性疾病，贫血症与移植物排斥的发生；而减弱的凋亡则可以导致自身免疫性疾病与癌症。而越来越多的研究发现对凋亡蛋白的泛素化修饰在细胞死亡信号通路中起着不容忽视的巨大作用。例如，  E3连接酶MDM2（murinedouble  minute  2）可泛素化p53,从而促进其降解[42];众所周知，  p53强大的肿瘤抑制功能来源于其在各种细胞应激条件下可作为转录因子调控一系列负责细胞 周 期 阻 滞 与 凋 亡 的 靶 基 因[43],而 在 小 鼠（Musmusculus）基因敲除试验中MDM2对p53的调控作用体现得淋漓尽致。小鼠单独敲除MDM2具有胚胎致死性，但同时敲除p53则可避免此效应。这种现象提示p53为MDM2的主要靶蛋白，而且当MDM2被敲除后p53水平会得到明显提高。另外，  p53敲除小鼠与p53及MDM2双敲小鼠容易患相同类型肿瘤，并具有十分类似的生存曲线，进一步证明了MDM2-p53之间的调控关系及其对细胞生存与肿瘤形成的巨大影响[44].
　　
　　凋亡抑制因子IAP（inhibitor  of  apoptosis）可影响半胱天冬酶（Caspase）与SMAC（second  mitochondrialactivator  of  caspases）的稳定性[45,46].通过对凋亡不同途径不同底物的泛素化修饰，  IAP不仅可抑制线粒体途径的凋亡通路，还可抑制外源性途径凋亡通路。XIAP（X  chromosome-linked  IAP）可直接与半胱天冬酶3, 7, 9相互作用而抑制其酶活性，并且将其泛素化而促进其降解。而在TNFR1信号通路中IAP1（C-IAP;也被称为BIRC3）和C-IAP2（也被称为BIRC2）则可负向调控半胱天冬酶8[47].  SMAC可结合到XIAP上而阻止其对半胱天冬酶的抑制，但C-IAP1可介导SMAC的泛素化与降解从而间接抑制凋亡通路[46,48].
　　
　　2泛素化修饰与疾病发病机理
　　
　　由于泛素化修饰在细胞功能的各方面都扮演着如此重要的角色，因此泛素化失调可产生一系列不良后果，例如，信号通路的异常激活或失活、蛋白质复合体形成异常、错误折叠蛋白累积或者蛋白质定位错误，而这都有可能参与疾病发展[49,50].由于蛋白酶体抑制剂在多发性骨髓瘤临床应用的成功[51,52],许多研究已将靶向泛素化通路作为一种有前景的治疗策略，接下来本文将以癌症与神经退行性疾病为重点，阐述泛素化异常如何参与与疾病发生发展而为其临床应用提供新策略。
　　
　　2.1泛素化修饰与肿瘤
　　
　　肿瘤发展是一个多步骤多阶段的递进过程包括促 进 肿 瘤 进 展 基 因 的 激 活 如 原 癌 基 因（proto-oncogenes）和抗凋亡基因（anti-apoptotic  genes）以及抗肿瘤因素的失活如抑癌基因（tumor  suppressor  genes）和促凋亡基因（pro-apoptotic  genes）[53].通过调控不同底物的稳定性与活性，泛素化影响了一系列肿瘤相关通路，甚至对于某一E3连接酶，由于底物的不同而使其同时具有癌基因与抑癌基因的功能。尽管这使治疗干预更加复杂，但由于E3连接酶是泛素系统中最具底物特异性的组分，它们依然是十分吸引人的药物靶点。
　　
　　（1）泛素化修饰与蛋白稳定性调控。   Ub连接酶通过调控癌蛋白与抑癌蛋白的稳定性而在许多方面参与到肿瘤发生发展。最着名的例子莫过于泛素化并降解抑癌蛋白p53的连接酶MDM2[54],与通过控制周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase）复合体与细胞周期抑制因子p27稳定性而调控细胞周期的SCF和APC/C连接酶复合体[55].参与细胞周期与检验点调控的E3连接酶对基因稳定性极为关键，而且此类连接酶的突变也并不局限于某一类型的肿瘤而是常见于各种类型并且与临床不良预后紧密相关。例如，前文中提到的E3连接酶中的Cbl家族成员通过介导激活的受体酪氨酸激酶的溶酶体分选与降解而参与肿瘤发生发展[56],其中E3连接酶c-Cbl的突变与异常表达在骨髓异常增生综合征肿瘤中最为常见，并且其突变也不断被发现于原发性结直肠癌及骨髓瘤中。
　　
　　另一个有趣的例子来自于逢希伯-林道肿瘤抑制基因（von  Hippel-Lindau  tumor  suppressor,  p VHL），p VHL的名字源于一种遗传性肿瘤综合征，患有此病的病人易患各种高度血管化的肿瘤如肾细胞癌、胰腺癌以及中枢神经系统肿瘤[ 5 7 , 5 8 ].而p VHL恰好是VCB-Cul2-VHL  Ub连接酶复合体中负责底物识别的关 键 组 分。在 缺 氧 条 件 下，缺 氧 诱 导 因 子- 1 a（hypoxia-inducible factor-1a, HIF-1a）可诱导血管内皮生长因子和葡萄糖转运体1的表达，而在正常情况下， HIF-1a可被p VHL识别并泛素化从而被蛋白酶体降解[59],当VHL基因发生突变时， HIF-1a难以被降解而稳定性异常增高，从而促进肿瘤的快速血管化而加快肿瘤生长。
　　
　　（2）泛素化修饰与蛋白活性调控。泛素化修饰也可以通过影响癌蛋白与抑癌蛋白的活性而参与肿瘤的发生发展。最好的例子莫过于小三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate, GTP）酶Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene, K-RAS），在缺乏受体刺激的情况下，对其单泛素化修饰即可激活K-RAS.在以往的研究中，研究者发现RAS被Rabex-5连接酶泛素化修饰可以调控其内体的定位[60],而被b-Tr CP连接酶泛素化则介导其蛋白酶体降解[61],然而近期研究却发现泛素本身可以影响K-RAS对GTP酶 激 活 蛋 白（GTPase-activatingproteins, GAPs）的反应从而增加GTP-RAS的量，进而增加下游通路的激活[62,63].另一方面，研究者又发现RAS的泛素化可以增强其与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol  3-kinase,  PI3K）的相互作用，从而强化PI3K-蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）信号通路。而这正是RAS突变体RAS  G12V致癌能力的机制之一。
　　
　　2.2泛素化修饰与神经退行性疾病