诱导多潜能干细胞转化为神经前体细胞的实验分析(2)

　　2. NPCs的诱导
　　
　　使用经EBs多步法将i PSCs诱导成NPCs（ 中国科学院动物研究所）。图2是连续培养传代中的NPCs,细胞以椭圆形为主，胞核大，胞体较圆，突起不发达，免疫荧光染色Nestin阳性（ 图4 ~ 6） ,其中有极个别的β-Tub-Ⅲ阳性细胞（ 图7 ~ 9）。
　　
　　3. NPCs的分化
　　
　　在分化培养基内培养7d的NPCs与在NPCs培养基内培养的细胞相比，细胞呈长梭形，多角形，细胞突起细长发达（ 图3） ,免疫荧光染色β-Tub-Ⅲ阳性细胞数增多，每个高倍视野3 ~ 5个（ 图10 ~ 12）。
　　
　　讨 论
　　
　　1.神经干细胞的判定
　　
　　神经干细胞能够自我更新，分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[14].本实验发现，利用经EBs,N2B27作为选择培养基，多步法贴壁培养诱导的NPCs,在体外可以不断地增殖传代，神经干细胞的标记Nestin阳性，极个别的细胞表达早期分化神经细胞的标记β-Tub-Ⅲ，经适当处理后，β-Tub-Ⅲ阳性细 胞 增 多。由 于NPCs培 养 基 成 分 复 杂，Neurobasal、B-27Supplement内的成分同样复杂，所以 很 难 解 释 去 除Neurobasal、B-27Supplement后β-Tub-Ⅲ阳性细胞增多的原因。目前的实验数据，该方法诱导的NPCs有神经前体细胞的特征，但还达不到NSCs的标准。
　　
　　2.神经前体细胞的分化
　　
　　关于NPCs的分化，根据文献[15,16],当去掉生长因子后NPCs向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。但我们先后在原有NPCs培养基的基础上分别去除b FGF、EGF或同时去 除b FGF、EGF,或在去除b FGF、EGF的基础上添加血清等，于培养3 ~ 5d后均出现NPCs死亡的现象。有研究表明，只用b FGF诱导随着传代次数的增加，细胞向胶质细胞分化[17]; 而EGF在NPCs诱导过程中至少发挥两个作用： 首先，与单独使用b FGF相比，EGF有赋予细胞形成神经的能力，不会使细胞随着传代次数的增加向胶质分化； 其次，EGF通过抑制凋亡维持细胞的自我更新，故本实验联合使用b FGF与EGF.有实验表明，在EGF缺失的情况下层黏连蛋白（laminin,LN） 可以维持细胞存活； 但去除EGF后，在LN上单独使用b FGF不能维持细胞增殖，这可以部分解释本实验去除EGF后，单独使用b FGF细胞死亡的原因。Okabe等[15]在诱导ESCs分化为NPCs的研究中使用m N3FL培养基对NPCs进行扩增，由于LN比纤维连接蛋白（fibronectin,FN） 对细胞的增殖有更高的刺激，所以m N3FL培养基内添加了LN和b FGF,去掉b FGF后NPCs向神经元和胶质细胞分化。而本实验在去掉b FGF后，细胞的死亡可能与缺少LN有关，这也提示单独EGF可能不足以维持细胞存活。如果单独1种因子不足以维持细胞存活，当两种因子去除后没有任何因子，细胞难以存活就更可以理解了。虽然更换分化培养基后β-Tub-Ⅲ阳性细胞增多，但就目前的资料，尚无法解释本方法诱导的NPCs没有分化的原因。
　　
　　3.拟胚体的培养
　　
　　EBs是ESCs在体外悬浮培养，生长增殖聚集，形成的具有三维特征的球状体（ 或称之为多细胞聚集物） ,由于这种球状体与其被植入体内后所形成的胚胎组织十分相似，故将其称之为拟胚体或类胚体。在这些聚集物内，不同种类细胞之间的复杂相互作用，可以诱导干细胞向3个胚层分化。拟胚体通常由具有3个胚层特性的衍生物所组成，可以认为是大多数成熟体细胞系的前体细胞。EBs的重新接种将导致进一步的分化和生长。
　　
　　与ESCs相类似，体外i PSCs未分化状态的维持，依靠细胞因子，比如白血病抑制因子（leukemiainhibitory factor,LIF） ,与gp130受体结合产生的作用。一旦这种自我更新的刺激去除后，i PSCs很快失去未分化的表型开始分化。EBs的形成就是抑制因子去除后i PSCs分化的结果。
　　
　　最早通过EBs诱导NPCs的实验是在不同的时间窗用维甲酸（retinoic acid,RA） 处理EBs,然后接种到不同介质的表面，接种后细胞出现神经元的形态，表达神经元特异的基因。诱导EBs形成的培养基是DMEM（ 高糖，含有谷氨酰胺，没有丙酮酸） 添加10%的胎牛血清（FBS） 和10%的新生牛血清，但是没有LIF,没有β-巯基乙醇[18].
　　
　　Wernig等[16]诱导i PSCs形成EBs,使用的培养基是DMEM含有10%的FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸、Hepes、β-巯基乙醇、青-链霉素。我们使用的是N2B27培养基。该培养基的成分很复杂，但共同点是都不含有LIF,这是保证i PSCs分化为EBs的先决条件。我们的培养基内不含有血清，可见血清不是EBs形成的必要条件。由此可见EBs的形成对培养基成分的要求不严格，在上述的各种培养基内，都能形成EBs.如果N2B27培养基不是后续实验的先决条件的话，我们可以考虑换一种简单廉价的培养基进行诱导。
　　
　　4. NPCs诱导培养基的选择
　　
　　本实验诱导EBs成为NPCs使用的是无血清选择培养基N2B27培养基，Okabe等[15]相同的实验使用的是ITSFn培养基，其成分是在DMEM/F12（1∶ 1）的基础上补充了胰岛素（5mg /L）、转铁蛋白（50mg /L）、硒酸钠（30 nmol / L） 和FN（5mg / L）。Oki等[19]使用的是DMEM/F12,2mmol/L L-谷氨酸，1. 6g /L葡萄糖，和N2supplement.N2supplement的成分有转铁 蛋 白 （10g /L）、胰 岛 素 （500mg /L）、孕 酮（0. 63mg/L）、腐胺（1. 611g/L）、亚硒酸盐（0. 52mg/L）。由此可见，虽然各个实验室所用的方法不同，但转铁蛋白、胰岛素、硒酸钠是它们共有的成分。转铁蛋白对细胞存活有普遍效应，胰岛素对Nestin阳性的细胞存活更特异[15].如果最终目的一致，第3种方案相对更简单。
　　
　　本实验仅对i PSCs向NPCs的分化进行了初步地探讨，使用经EBs,以N2B27作为选择培养基，多步法贴壁培养可将i PSCs诱导为有一定神经特征的前体细胞。
　　
　　参 考 文 献
　　
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