N-dots的制备方法、研究进展和发展方向

　　摘    要：　氮量子点(N-dots)作为继碳量子点(C-dots)之后量子点家族新成员，具有优异于C-dots的光电特性、生物相容性和易功能化等特点，备受广大科研人员青睐。随着研究的深入，水热法、微波法和光化学法相继问世，然而，不论哪一种方法其原料来源都极其单一，因此开发不同种类的N-dots制备前驱体也成为研究人员主要工作之一。作为量子点家族后起之秀，N-dots凭借光稳定性强、量子产率高及生物相容性好等优点迅速在纳米探针、荧光标记以及生物医药领域实现了应用。本文综述了N-dots的研究进展，分析了不同制备方法的特点，总结了在各领域的应用，对N-dots的未来研究与发展前景进行了展望。

　　关键词：　氮量子点; 水热法; 光化学法; 荧光标记;

　　Abstract：　As a new member of the quantum-dots family,nitrogen-rich quantum dots( N-dots) have attracted considerable attention owning to the outstanding optical and electronic properties,excellent biocompatibility and easy functionalization compared to Carbon quantum dots. With the development of technology,hydrothermal treatment,microwave synthesis and photochemical avenue have been used for preparation of the N-dots. However,each method has a very single source of raw materials. Therefore,exploring different precursors has become one of the main task of researchers. As a rising star of quantum dots family,N-dots have displayed wide applications in numerous fields such as nanoprobes,fluorescent labelings and biomedicines because of their strong photostability,high quantum yield and favorable biocompatibility. This paper describes the Preparation and application progress of N-dots,analyzes the characteristics of the different preparation methods,summarizes the applications in various fields. Finally,the future research and development of the N-dots are prospected.

　　Keyword：　Nitrogen-rich quantum dots; Hydrothermal treatment; Photochemical avenue; Fluorescent labeling;

　　0、 引言

　　自1983年Brus等[1]发现Cd S量子点以来，量子点凭借发射波长可调、吸收峰宽、荧光量子产率高、稳定性好等优点逐渐成为纳米材料领域的研究热点。之后，Cd Se、Cd Te量子点等[2]含重金属量子点的研究也逐渐增加，但重金属元素使量子点具有生物毒性，限制了其应用，开发无毒性的量子点成为新的研究方向。2004年，Xu等[3]在分离、提纯单壁碳纳米管时首次发现了C-dots，之后C-dots引起了广泛关注，已被应用到催化、生物和光电等领域[4]。相比于传统无机半导体量子点，C-dots的荧光量子产率低。为了解决这个问题，研究人员通过氮掺杂去增加C-dots的活性位点和量子产率[5]。然而，现有的掺杂方式条件苛刻，掺入的氮元素含量低且仅存在于C-dots表面，限制了其应用[6,7]。因此，研究人员致力于开发一种以氮元素为基础的新型纳米材料。2014年汤新景课题组首先提出N-dots，该量子点具有水溶性好、光稳定性优异和生物相容性好等优点[8]，在分析检测、荧光标记、生物医学领域具有广泛的应用前景。本文综述了N-dots的制备方法以及在分析检测、荧光标记、生物医学领域的研究进展，展望了N-dots在未来的发展方向。
 

　　1 、制备方法

　　目前，N-dots的制备方法主要有水热法、微波法和光化学法三种方法。

　　1.1、 水热法

　　水热法是一种简便、低成本且环境友好的纳米材料合成方法。Chen等[8]将2-叠氮咪唑在甲醇中以一定温度加热24h，制备了不同粒径的N-dots，其氮含量最高可达34.48%。为了减少反应时间，Gu等[9]将氨水作为亲核试剂引入甲苯、2-叠氮咪唑和苄基三甲基溴化铵体系混合加热，在水热反应过程中，氨水不仅参与了开环反应，还促使N-dots的合成、表面钝化以及功能化三个过程同时完成，反应效率显着提高，2小时即可制得平均粒径5.5nm的N-dots。制备氮含量高的N-dots是研究人员一直致力于攻克的难题，Zheng等[10]以5-氨基四唑为原料，将其溶于水在200℃下加热，获得了粒径范围在2-5nm的N-dots。引人关注的是，该方法制备的N-dots氮元素含量高达57.27%，是碳元素含量的1.6倍，如此高的氮含量是之前从未报道过的。尽管水热法被广泛应用，但是水热法制备周期长，制备的稳定性和重复性较差，且关于晶体生长过程影响因素的控制缺乏深入研究。因此，寻找高效的N-dots制备方法迫在眉睫。

　　1.2 、微波法

　　基于微波升温迅速、温度梯度小和穿透力强等优势[11],2008年，Zhu等[12]首次提出利用微波法一步快速合成C-dots。Tang等[13]用微波对2-叠氮咪唑和氨水进行加热，仅用8分钟制得了表面富含氨基的N-dots。微波合成的N-dots性能优异，荧光量子产率高达34%，氮含量达到40%。在N-dots生成的同时，氨水不仅参与了开环反应，同时也参与了N-dots的表面钝化。虽然微波法方便、快捷，但是对温度和时间的控制要求比较严格，量子点尺寸难以控制[14,15]。

　　图1 微波法制备N-dots原理图[13]

　　1.3、光化学法

　　光化学法具有反应时间短、绿色快捷、反应进程可控的优势，早在1980年被日本科学家用于制备荧光尿嘧啶[16]。之后，光化学法也广泛应用于纳米材料的制备，如纳米银颗粒[17]、石墨烯[18]和硫化镉[19]等。2017年，Jin等[20]首次采用光化学法合成了N-dots，该方法将2-叠氮咪唑溶于甲醇，置于365nm的紫外灯下进行反应，制得了2～4nm的N-dots，产率高达92.7%，远高于水热反应的产率33%。光化学法制备N-dots具有产率高、时间短、所得样品水溶性好的优点，是一种极具应用前景的合成方法。

　　2 、N-dots的应用

　　N-dots具有优异的光学性质、良好的生物相容性、响应性荧光淬灭/增强性质，以及易于修饰和功能化。这些特性使其在分析检测、荧光标记和基因与药物投递领域有着广泛应用。

　　2.1、 分析检测

　　2.1.1 、重金属离子检测

　　环境中的重金属离子不仅破坏自然环境，也对人体健康造成严重影响[21]。尽管C-dots作为荧光探针对重金属离子进行检测已经实现，但是C-dots苛刻的制备条件限制了它的应用[22]。N-dots因其制备条件温和，表面基团丰富且易功能化引起了研究人员广泛关注。Wu等[23]将N-dots用于水溶液中银离子和汞离子的检测。银离子和汞离子都能使N-dots的荧光迅速淬灭，但是汞离子使N-dots的荧光淬灭速度更快，两者的检测极限分别为0.48μM和0.63μM。荧光淬灭后往体系中加入乙二胺四乙酸，汞离子体系荧光恢复，这是由于汞离子与EDTA的亲和力大于汞离子和N-dots的亲和力，如图2所示。张[24]采用聚乙烯亚胺修饰的N-dots对铜离子进行检测，研究发现在一定范围内，N-dots溶液的荧光强度随着铜离子含量的增加而降低。在p H=3时，荧光淬灭效果最好，对铜离子的检测极限为51n M。

　　图2 N-dots检测Hg2+和Ag+示意图[23]

　　2.1.2、分子检测

　　人体内半胱氨酸的含量预示着人体健康水平，因此将量子点设计成荧光探针对半胱氨酸含量的检测意义重大[25,26]。2017年，Tang等[13]将N-dots与金纳米粒子设计成荧光探针，对半胱氨酸含量进行检测，如图3所示。研究表明，N-dots与金纳米粒子比例为4:1，体系p H=7.4时，探针效果最好，检测范围0.3～3μmol/L。在此基础上，N-dots荧光探针成功用于血清和血浆中的半胱氨酸检测，恢复范围为90～106.7%。基于该探针良好的细胞膜通透性和生物相容性，也成功应用于人类肺腺癌细胞中的半胱氨酸成像。2018年，Gu等[9]将N-dots与铜离子设计成半胱氨酸探针，成功应用于人体血清和血浆中的半胱氨酸检测，检测极限5.3n M，恢复范围97.2～105.7%，且成功应用于活体细胞中的半胱氨酸成像，在临床诊断上具有广阔应用前景。

　　图3 N-dots与金纳米粒子作为探针检测半胱氨酸示意图[13]

　　以N-dots为基础的荧光探针除了应用在生物体内分子检测外，对生物体外分子探测亦具有强烈的选择性和高的灵敏度。Nie等[27]首次将N-dots与聚多巴胺组装成荧光探针并负载在滤纸条上，实现了溶液中对硝基苯胺的检测。该探针能够精准识别并捕获对硝基苯胺，当对硝基苯胺浓度范围在5nmol/L～1μmol/L时，探针的荧光强度与对硝基苯胺的浓度呈线性关系，最低的探测极限1.65nmol/L。Zou等[28]用N-dots作为荧光分子，氧化石墨烯作为控制器，构建了以氢键为基础的纳米荧光探针，并应用于焦磷酸盐的检测。基于共振能量转移机制，N-dots与氧化石墨烯结合后，N-dots荧光发生淬灭，当焦磷酸盐存在时，荧光效应恢复。当焦磷酸盐浓度在0～400μm范围时，荧光强度与焦磷酸盐浓度呈线性关系，其最低检测极限为8.3n M。

　　N-dots作为荧光探针用于分析检测已被广泛应用，而作为表面增强拉曼散射增强剂对物质进行检测却少有报道。近年来，表面增强拉曼散射技术因其灵敏度高、选择性强、对样品无损以及对表界面原位分析检测的能力等优点成为了重要的分析手段之一，在分析检测领域得到了广泛应用[29,30]。Lin等[31]将N-dots与银纳米离子复合并作为增强剂，以硅为基底，利用表面增强拉曼散射检测水溶液中的孔雀石绿和龙胆紫。值得注意的是，在复合的过程中，N-dots因其表面富含氧与氮的官能团作为还原剂使得反应短时间内在温和的条件下得以完成。与此同时，N-dots也作为稳定剂使银纳米粒子的水溶液中稳定存在。基于N-dots修饰的银纳米粒子，表面增强拉曼散射能对水中的孔雀石绿和龙胆紫实验高精度、高灵敏度探测。对于孔雀石绿，浓度在10～1000nmol/L范围内，散射强度与浓度成线性关系，最低检测极限为2.7n M;对于龙胆紫，浓度在5～100nmol/L范围内，散射强度与浓度成线性关系，最低检测极限为2n M。

　　化学发光是常见的分析检测技术之一，与荧光探针分析相比，化学发光无需激发光，因此仪器结构更简单且具有灵敏度高、信噪比高、检出限低、线性范围宽等优点[32,33]。Zheng等[12]将N-dots溶液注入到Na IO4-H2O2化学发光体系中，使得溶液的化学发光强度增强了400倍。当N-dots加入到反应体系后，溶液颜色由无色变成了亮黄色，这表明N-dots改变了H2O2和Na IO4原来的反应。体系的发光机理为单线态的氧与N-dots之间的能量共振转移和N-dots辐射电子-空穴对的湮灭。Fu等[34]用N-dots与高碘酸银钾组合成化学发光体系，并用于阿魏酸的检测。阿魏酸能够有效抑制N-dots-高碘酸银钾系统的化学发光强度，当阿魏酸浓度在3x10-7～1x10-5g/m L时，化学发光强度与阿魏酸浓度呈线性关系，最低检测极限为8x10-8g/m L。这是N-dots首次基于化学发光对物质进行检测，为N-dots在化学发光上的应用提供了极具参考性价值的信息。

　　图4 N-dots-Na IO4-H2O2体系化学发光机理示意图[12]

　　2.2 、荧光标记

　　2.2.1、 荧光墨水

　　荧光防伪技术具有成本低廉、操作方便且具有可调荧光强度和响应外部刺激等特点受到人们的普遍关注，其关键是寻找优异的荧光墨水[35]。N-dots具有水溶性好、耐光漂白、荧光性能好、无毒和光稳定性强等优点，是一种优秀的荧光墨水，对信息的加密和防伪具有重要意义。Chen等[8]用毛笔蘸取N-dots溶液在滤纸上书写了N-dots和PKU字样。该字样在太阳光下是不可见的，只有在365nm紫外灯的照射下才能清晰可见。将书写好字样的滤纸浸入水中后再进行观察，字样仍清晰可见，这是常规的荧光墨水所不能达到的效果。除此之外，N-dots还可对棉线、丝绸、聚丙烯酰胺凝胶进行染色，染色后进行充分水洗，仍能在紫外灯和荧光显微镜下观察到荧光。

　　2.2.2 、细胞成像

　　细胞的荧光成像是深入了解癌细胞的病变发展的一种追踪方式，为再生疗法和免疫反应提供一定的基础[36]。N-dots具有表面官能团丰富、低毒性、光稳定性强、荧光可调等优点，为其在细胞成像的应用提供了可能。2014年，Chen等[8]成功将N-dots用于线虫细胞成像。将线虫置于浓度为0.5mg/m L的N-dots溶液中培养之后，用荧光显微镜在不同激发波长下可观察到线虫呈蓝绿色、绿色和红色荧光。2017年，Jin等[20]将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7cells)与N-dots溶液培养6h后，当激发波长为770nm时，可在多光子共聚焦显微镜下观察到细胞发出蓝色和绿色荧光，而细胞在显微镜下的明场像是无色的。细胞的叠加图像表明两个通道中的光致发光来自相同的N-dots。与此同时，细胞的光致发光成像也说明N-dots是位于细胞的细胞质中，并不是细胞核，这与C-dots在细胞中的分布是一致的[37]。

　　2.3 、基因与药物投递

　　借助量子点材料，实现基因与药物在生物体内的靶向运输和精准投递是生物医学的重大突破之一。N-dots制备条件更温和、更易功能化，生物相容性更好，在基因与药物投递方面具有应用前景。Zhang[24]以聚乙烯亚胺修饰的N-dots为载体，成功将红色荧光蛋白(REP)和Cy5-siRNA转运到B16细胞中为了将聚乙烯亚胺修饰的N-dots更好应用于基因与药物投递，并对实验条件进行了优化。研究发现，无论是直链还是支链聚乙烯亚胺修饰的N-dots，其浓度越高，对B16细胞的伤害也越大，但总体来说，直链的毒性要小。直链聚乙烯亚胺修饰的N-dots半抑制浓度为100μg/m L，支链的为25μg/m L。然而，不管是REP还是Cy5-siRNA，支链聚乙烯亚胺修饰的N-dots投递效率都比直链的高。

　　3 、结论与展望

　　N-dots作为量子点家族的新成员，对其研究工作主要集中在开发不同的制备方法以及拓宽应用领域。在合成方法上，已有水热法、微波法、光化学法三种。其中水热法因制备工艺简单、绿色环保被广泛采用，但是，水热法制备周期长限制了它的应用;微波法方便快捷，在短时间内即可获得产物，但产物尺寸受功率和时间的影响，难以控制;光化学法绿色高效且反应进程控，应用潜力巨大。然而，现有制备方法都存在前驱体单一的缺点，因此，开发不同的氮量子点前驱体以及高效的制备方法是研究人员未来的主要研究方向。在应用方面，N-dots已被成功应用于分析检测、荧光标记以及生物医学领域。基于N-dots具有比C-dots更加优异的光学特性、生物相容性和易功能化等优点，相信在不久的将来，氮量子点在分析检测、荧光标记、生物医药、光催化等领域将得到广泛应用。

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