郴州是华南地热资源最丰富的地区之一，所属的南岭山地是我国重要生物区系的分界线。郴州汝城温泉是我国南方水温最高，流量最大，水质最好，热田面积最宽的天然温泉。嗜热菌是一类在高温环境中生长繁殖的极端微生物，主要包括细菌、古菌和真菌[1-3],存在于含硫的热泉、泥潭、海底热溢口等[4-5],在嗜热微生物研究中可培养的细菌数量少，选择不同培养基分离培养，能得到更多可培养嗜热菌，丰富其资源。因此，本研究以湖南汝城温泉为研究对象，使用DSM88,牛肉膏蛋白胨，高氏一号三种培养基分离培养，为发现新的嗜热物种，丰富我国极端微生物的生物多样性提供基础。
1材料与方法
1.1样本采集
热水镇（北纬25°31'47.29″，东经113°54'48.19″）：A（68℃，藻类），B（94℃，泥水混合物），C（86℃，泥水混合物），D（90℃，泥水混合物）。罗泉（北纬25°36'24″，东经113°40'3″PH6.5~7.0）：48℃，泥水混合物。
1.2仪器与试剂
蛋白胨，牛肉膏，琼脂粉（北京奥博新生物技术责任有限公司）；七水合硫酸亚铁（AR）；移液枪；高压蒸汽灭菌锅（07B-2242型，江阴滨江医疗设备有限公司）；超净工作台；电热恒温培养箱（DHP-420型北京市永光明医疗仪器有限公司）；BA-4032快速革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司）等。
1.3培养基
以嗜热菌DSM88培养基[6-7]为基础，配制（NH4）2SO4130g、KH2PO428g、CaCl25.3g、MgSO4·7H2O25g、FeCl3·6H2O2g、MnSO4·H2O2.2g、Na2B4O7·10H2O4.5g、ZnSO4·7H2O0.5g、CuSO416g、NaMoO4·2H2O25g、CoCl2·6H2O46gYeastextract1.0g、Tryptone1.0g.调PH值至7.6,灭菌，121℃20min.
牛肉膏蛋白胨培养基[8-9]:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g/L、琼脂18g,调PH值至7.6,灭菌121℃20min.高氏一号培养基[8]:可溶性淀粉20g、K2HPO40.5g、KNO31g、MgSO4.7H2O0.5g/L、NaCl0.5g,琼脂20g、FeSO4.7H2O0.01g,调PH至7.6,灭菌121℃20min.
1.4细菌的培养，分离纯化
1.4.1样品处理
将样品泥水混合物（样品A、B、C、D）和泥水混合物样品1、2、5）充分震荡，各自用无菌水稀释，制备10-1、10-2、50μl无菌水×50μl样品的稀释液。
1.4.2细菌的培养
用eppendorf移液枪分别取100μl各稀释度样品涂布于DSM88、牛肉膏蛋白胨、高氏一号培养基平板上，每个样品每种稀释度涂布两个。将平板倒置，用记号笔标上编号、稀释度，日期标号放入恒温培养箱（罗泉样品于50℃，热水样品于60℃）连续培养5天，每天观察菌的生长情况并对三种培养基平板菌落数量、种类计数。用接种环在三种培养基上挑选单个菌落将单菌落分别转接划线在与原先相同的培养基平板上，分离纯化。
1.5菌体形态观察
1.5.1菌落形态
单个菌落分离纯化之前，在培养皿上用记号笔将菌落标记，同时对菌落的大小、形态、颜色、培养时间进行记录。分离纯化长出菌落3天后同标记的一一对应进行形态观察记录，BaSO快速革兰氏染色对三种培养基中菌株的革兰氏染色属性和结构鉴定。
1.5.2根据BaSO快速革兰氏染色说明书（制片、初染、媒染、脱色、复染、镜检）对分离培养出三天的菌革兰氏染色。
1.5.3光学显微镜观察
将制好的涂片滴加香柏油，用油镜观察细菌形态及属性。
1.6嗜热菌的生理生化试验根据细菌鉴定手册和文献[10-13]描述鉴定项进行生化鉴定。项目包括：糖发酵试验，H2S试验，枸橼酸盐利用，吲哚试验，V-P试验，甲基红，动力，克氏双糖铁。
2结果
2.1分离出细菌数
用三种培养基共培养出81个菌株。
2.2三种培养基中嗜热菌形态特征
2.2.1罗泉样品（共分离出41株），革兰氏染色阳性菌有28株，阴性菌有13株，6株球菌，35株杆菌，各培养基分离出菌株形状及颜色的数量不同（表1）。
DSM88培养基中分离出23株，其中特殊菌N1,表面形态是一种颗粒状，乳白色，稍透明，表面粗糙干燥的菌，革兰氏染色为球菌。将此菌接种在牛肉膏蛋白胨和高氏一号培养基中能生长，但生长速度慢；牛肉膏蛋白胨培养基中分离出15株，其中特殊菌N11,表面形态是一种小颗粒围成圈形，黄色，表面粗糙的菌，革兰氏染色长杆；高氏一号培养基中分离3株，其中优势菌N（2），表面形态是一种不规则，表面非常湿润，脓状菌，早期偏黄色，倾斜培养基后具有流动性，流动过的地方还能生长，晚期为黄绿色，向上突起生长，成粘稠状。革兰氏染色长杆。
DSM88培养基和牛肉膏蛋白胨培养基培养两者共有5种相同形态的菌株：N5/N牛7,N8/N牛4,N12/N牛10,N20/N牛14,N21/N牛13.
2.2.1热水样品（共分离出40株），革兰氏染色阳性菌有22株，阴性菌有18株。1株球菌，39株杆菌。各培养基分离出菌株形状及颜色的数量不同（表2）。
DSM88分离培养出25株，其中优势菌R10,表面形态是一种圆形，呈红色，边缘有透明环，表面光滑湿润的菌，革兰氏染色杆状。牛肉膏蛋白胨培养基分离出6株，其中特殊菌R⑤，表面形态是一种不规则，中间为乳白色，外周呈黄色，表面粗糙干燥的菌，革兰氏染色杆状。高氏一号培养基分离出9株，其中特殊菌R（8），表面形态是一种不规则，有突起，橙红色，表面光滑的菌，革兰氏染色长杆。
DSM88培养基和牛肉膏蛋白胨培养基有两种相同形态的菌：R9/R④，R17/R①。高氏一号与DSM88相比有两种相同形态的菌R1/R⑴，R9/R（5）。三种培养基分离培养嗜热菌，DSM88培养基上生长的菌落最早，数量和种类最多，生长速度最快，DSM88为最适培养基，PH在7.6左右。
【1】
2.4生理生化试验结果
暖水样品41株菌中，葡萄糖发酵试验产酸40株，产气19株；乳糖发酵试验产气39株，产酸2株；克氏双糖铁产酸25株，产气12株；H2S呈阳性36株；甲基红呈阳性2株；吲哚呈阳性2株；VP呈阳性13株；枸橼酸盐利用试验全为阳性，均有动力（表3）。热水样品40株菌中，葡萄糖发酵试验产酸31株，产气37株；乳糖发酵试验产气39株，产酸0株；克氏双糖铁产酸36株，产气28株；H2S呈阳性20株。
【2】
【34】
3讨论
极端微生物是在长期自然选择压力下形成自身特殊与结构稳定、技能和遗传物质以应对相应的极端环境因子，具有巨大的开发价值[14-15],嗜热菌需要独特的高温生活环境和生理需求，各种菌群之间存在拮抗、协同作用、共代谢等[16],适应力强细菌继续生长，而弱的会因营养匮乏而抑制[17],传统培养方法[18]具有局限性，容易使一些未知的菌在培养的过程中丢失[19-21],因而培养出的微生物只占自然环境中的少部分[22-23].
本研究利用3种培养基共分离出81株菌，说明汝城温泉里含有丰富的嗜热菌。DSM88培养基中生长速度最快，菌株种类最多，占59.3%;牛肉膏蛋白胨培养基占25.9%;高氏一号培养的菌株速度最慢，菌株数最少，种类最少，占14.8%,结果显示DSM88培养基最佳，牛肉膏蛋白胨培养基强于高氏一号培养基。可能原因是DSM88培养基主要培养嗜热菌，牛肉膏蛋白胨培养基广泛运用于培养细菌而高氏一号适用于培养放线菌。目前研究中很少使用牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基在高温下分离培养温泉中嗜热菌，因为每种培养基都能分离培养出其他培养基培养不出的特殊菌，通过选用这3种培养基来获得更多的可培养的嗜热菌，发现新的嗜热物种，丰富我国极端微生物的生物多样性。革兰氏染色阳性菌有50株；阴性菌有31株，菌株形态：6株球菌，75株杆菌，与其他温泉中有丰富的嗜热芽孢杆菌相似[23].在PH7.6条件下，50℃暖水样品和60℃热水样品中DSM88培养基培养数量相差不大，牛肉膏蛋白胨在暖水中培养嗜热菌的能力优于热水样品，高氏一号培养基在热水样品中分离培养嗜热菌多于暖水样品，可能是温度，地理位置，水化学性质，分布情况不同影响可培养嗜热菌[16,24].葡萄糖发酵产酸占87.7%,产气占69.1%,乳糖发酵产酸占2.5%,产气占96.3%,枸橼酸盐利用试验显阳性数量占50.1%,动力占95.1%,嗜热菌多数有动力，不同的微生物在代谢类型上有很大差异，不同细菌分解和利用蛋白质、糖类的能力不同，因此其发酵类型和产物也具有多样性，不同嗜热菌具有不同酶系统，使用生理生化试验不仅在菌株鉴定中有很大作用，也对接下来做产酶、产糖试验提供基础。
三种培养基中DSM88培养基为嗜热菌最佳培养基，采用不同培养基可得到更多的可培养嗜热菌，为丰富我国极端微生物种群多样性提供方法。
参考文献：
[1]欧平。嗜热菌的研究进展[J].贺州学院学报，2009,25（4）：136-139.
[2]万滋衡，龚逢平。湖北咸宁温泉嗜热菌的分离与初步鉴定[J].中国卫生检验杂志，2010,20（11）：2827-2828.
[3]晏爱芬，余丽，林连兵。腾冲热海嗜热芽孢杆菌的分离鉴定[J].科学技术与工程，2012,12（15）：3565-3566.
[4]晏爱芬，林连兵。腾冲热海硫化叶菌的分离与特征研究[J].安徽农业科学，2011,39（3）：1271-1272.
