不产氧光合细菌(APB)代谢方式灵活多样,可营光能自养和异养、化能自养和异养生长,不仅是光合作用和生物固氮等机理研究的模型生物,而且在畜禽、水产和农业种植等领域也显示出诱人的应用前景。
APB富含的细菌叶绿素(BChl)和类胡萝卜素(Car)是构成光合作用光系统的最主要功能成分,在光能的捕获、传递和转化成化学能的过程中具有至关重要的作用。自从Cohen-Bazire等首次开展光合色素合成调控研究以来,APB光合色素和色素蛋白复合体的环境适应性调控研究一直是国际研究热点,例如:在Rhodobacter sphaeroides、R.capsulatus和Rubrivivax gelatinosus等菌种中相继发现AppA/PpsR、PrrBA、FnrL、RegAB、CrtJ、AerR和FixLJ-K等调控系统或者信号蛋白,基本阐明了光合色素合成的光氧调控机制;Mizoguchi和Harada等揭示了BChl a合成的最后4步反应,又进一步阐明紫细菌中普遍积累这4种BChl a相应的4种细菌脱镁叶绿素(BPhe)a,但由于菌株的差异和环境因子的不同,光合色素的组成和含量也有较大差异;在Rhodopseudomonas palustris中,随光强升高,NBRC100419菌株积累的Lycopene和3,4-Didehydrorhodopin含量升高,Spirilloxanthin含量降低,而在Rits、CGA009、Morita和RhodospirillumrubrumS1等菌株中则表现出相反结果。由此可见,在不同的菌株中,光和氧对细胞内光合色素的积累呈现不同的变化规律。除此之外,也有许多关于营养基质以及APB生长抑制剂等对光合色素调控的报道。盐度也是重要环境因子,对微生物的生长具有重要作用,依据盐的依赖性和耐受性不同,可分为非嗜盐、轻度嗜盐、中度嗜盐和极端嗜盐微生物。盐对APB生长代谢影响的研究已有很多报道,主要集中在菌株耐盐能力,以及细胞内相容性溶质和细胞膜脂质成分等耐盐机制等方面,对光合生物光合色素调控虽然也有许多研究,但主要集中在植物、藻类和蓝细菌,尚未见到盐对APB光合色素组分和含量影响规律的系统报道。本课题组从新疆盐碱土壤中分离到一株能够耐盐Rhodobacter.capsulatus XJ-1菌株,在前期光和氧调控光合色素合成研究基础上,进一步研究了盐度对XJ-1菌株生长、BChl和Car合成的调控作用,为进一步进行盐度调控光合基因表达的分子机制研究奠定基础。
1、材料和方法
1.1菌株荚膜红细菌。XJ-1由本实验室分离、鉴定并保存,GenBank登录号为HM370064.
1.2培养基采用改良的Ormerod培养基,用2.46g/L乙酸钠取代其中的6.0g/L苹果酸钠,以1.0g/L谷氨酸钠为氮源,pH 7.0。
1.3 NaCl对生长的影响。培养基中分别添加不同浓度的NaCl。接种量为1%,设3个重复,置28℃,2500lx光照厌氧培养。不同时间取样,于UV-2102PCS型紫外可见分光光度计(MAPADA)测定菌体生物量和活细胞吸收光谱。每组实验重复3次取平均值。
1.4生物量的测定。采用比浊法,用1cm石英比色杯于UV-2102PCS型紫外可见分光光度计上测定波长660nm处的光密度(OD660),以OD660表示菌体生物量。
1.5活细胞吸收光谱测定。离心收集光照厌氧培养物菌体细胞,于pH 7.5,10mmol/L Tris-HC1缓冲液洗涤2次,悬浮于质量60%蔗糖溶液,用光程为1cm石英比色杯,于UV-2102PCS型紫外可见分光光度计上进行波长扫描。
1.6色素含量测定。离心收集光照厌氧液体培养物菌体细胞,蒸馏水洗涤3次。菌体依次用甲醇、丙酮甲醇 (7∶2,V/V)和丙酮各提取1次。离心收集上清,残余物继续依次加入提取剂重复上述处理过程,最后合并提取液。Car的定量按Jessen公式进行计算,C=(D·V·f ×10)/2 500,其中C为Car量(mg),V为提取液总体积(mL),f为稀释倍数,D为Car最大吸收峰的光密度,2 500为Car平均消光系数。BChl含量参Beer-Lam-bert-Bouguer定律进行计算,C= D·V·f/(a·L)×103,其中a为消光系数(l·g-1·cm-1),L为光程(cm)。全色素总量是Car总量和BChl总量之和。色素提取在黑暗中进行。每组实验重复3次取平均值。
1.7色素组分的TLC分析。色素提取液经减压蒸发干燥,用乙醚溶解,在硅胶G板上进行点样,展层剂为石油醚、正己烷、异丙醇、丙酮和甲醇(8∶0.75∶0.2∶0.8∶0.25,V/V),展层结束后立即拍照,得到色素的TLC指纹图谱图像,再用Gel-Pro analyzer软件进行灰度分析。
1.8色素组分的鉴定。从TLC层析板上刮取各条带色素,溶于丙酮中,充分振荡,离心取上清,用光程为0.2cm石英比色杯,于UV-2102PCS紫外可见分光光度计上进行波长扫描。依据吸收光谱、极性、球形烯合成途径和文献数据对色素组分进行鉴定。
2、结果和分析
2.1 NaCl对菌株XJ-1生长的影响
如图1A所示,随NaCl浓度增加至0.2mol/L时,菌体的生长速率和最终生物量逐渐升高并达到最大,继续增加NaCl浓度,菌体的生长速率和最终生物量则逐渐降低。菌株XJ-1生长不需要NaCl即可良好生长,最适NaCl浓度为0.2mol/L,达到0.4mol/L NaCl时,菌体仍能生长。这表明菌株XJ-1是一株耐盐菌,与文献报道的R.capsulatus E1F1菌株的耐盐特性有差异。
2.2 NaCl对菌株XJ-1吸收光谱的影响
菌株XJ-1在含有NaCl的培养基中光照厌氧生长72h,液体培养物呈黄棕色,其活细胞吸收光谱如图1B所示。培养基中未添加NaCl时,细胞呈现376nm、590nm、804nm和860nm BChl系BChl a特征光谱和447nm、480nm和510nm球形烯系Car特征光谱。当培养基中含有≤ 0.3mol/L NaCl时,与对照相比,各特征峰未见明显变化,位移在0~4nm内,当含有0.4mol/L NaCl时,仅显示微小的802nm和863nm吸收峰,其他色素峰均不明显。
2.3 NaCl对菌体色素含量的影响
如图1C所示,当NaCl浓度为0~0.2mol/L时,随着盐度增加,菌体积累的BChl a和Car含量逐渐升高,若继续增加NaCl浓度,菌体积累的BChl a和Car含量则逐渐降低。
2.4色素组分的TLC分析菌株XJ-1光合色素的薄层层析(TLC)
如图2A所示,色素TLC图谱呈现分辨良好的6条色带,色带的颜色分别为绿色(T1)、紫色(T2)、紫色(T3)、黄色(T4)、红色(T5)和黄色(T6)。在含有0.2和0.4mol/LNaCl培养基中,菌体积累6种主要的色素组分,与未添加NaCl培养物对照相比(CK),盐浓度下菌体细胞又新合成了一种紫色条带(T2)。
TLC图谱各色带吸收光谱如图2B所示,依据吸收光谱特征吸收峰数据及相关文献数据,T1鉴定为BChl a衍生物,T2和T3为细菌脱镁叶绿素(Bphe),但T2特征吸收峰为356nm、384nm、526nm、681nm和738nm,与文献报道数据有所差异;T4和T6分别为羟基球形烯(OH-SE)和球形烯(SE),T5为球形烯酮(SO)。
利用Gel-Pro analyzer软件将TLC图谱转化为色素的灰度(Intensity)对Rf的曲线,如图2C所示。用各色素条带的灰度的相对面积表示其相对含量,如图2D所示。未添加NaCl时,菌体细胞主要积累5种色素组分,分别为BChl a、Bphe、OH-SE、SO和SE,其中Bphe和OH-SE相对含量很低。当NaCl浓度为0.2和0.4mol/L时,菌体细胞额外积累了一种Bphe组分。随着NaCl浓度升高,菌体积累的BChl a和SE的相对含量降低,2种Bphe组分的相对含量则增加,而OH-SE和SO则呈先升后降的趋势。由此可见,菌株XJ-1光合色素的积累对盐度变化的响应灵敏,随着盐度的变化,菌体光合色素的积累量与菌体的生长相关联,光合色素的组分和相对含量也随之发生了规律性的变化。
3、讨论
APB类群广泛分布于自然环境中,从淡水到饱和卤水盐浓度范围都能发现它们。已有研究表明,自然生境中的盐浓度是决定特定APB种类生长繁殖的一个重要的选择性因子。荚膜红细菌广泛分布于富含有机物的淡水水体和土壤环境中,耐盐能力较低,Ige珘no等较为详细地报道了一株具有耐盐能力的R.cap-sulatus E1F1菌株,无盐时生长最好,在0.1~0.3mol/L NaCl范围内,随盐度增加,生长逐渐受到抑制。
本研究的XJ-1菌株最适生长的NaCl浓度为0.2mol/L,与E1F1菌株的耐盐特性明显不同。众所周知,光合色素是光合生物营光合作用生长的核心功能成分,生物体内积累的光合色素受环境因子调控。APB富含BChl和Car两大类光合色素,其结构明显不同于植物、藻类和蓝细菌的光合色素。关于盐对光合色素影响的报道主要集中在植物、藻类和蓝细菌,如在0.05~0.2mol/L NaCl环境中,随浓度升高,泡桐无性系叶绿素和类胡萝卜素含量呈下降趋势。
Singh等研究表明,0.2mol/L NaCl抑制蓝细菌(Fremyella diplosiphon)叶绿素的积累。目前尚未见到盐对APB光合色素响应研究的系统报道。本研究结果表明:不同盐度对XJ-1菌株的生长和光合色素的合成具有明显的影响,0~0.2mol/L NaCl范围内,随盐度增加,菌体的生长速率、最终生物量以及积累的BChl a和Car含量升高,继续增加盐度,菌体生长速率、最终生物量以及积累的BChl a和Car含量又逐渐降低。
最近研究表明:在紫细菌中普遍存在4种BChl a中间产物BChl aGG、BChl aDHGG、BChl aTHGG和BChlaP,但4种BChl a的相对含量因环境条件和菌株而异;另外,菌体中也积累4种BChl a相应的BPhe a,主要分布于反应中心(RC)复合体中,其含量远远低于相应的BChl a含量,但BPhe在细胞内的形成机制尚不清楚。本课题组前期研究结果表明:在光照厌氧和黑暗好氧条件下,该菌株只积累1种BChl a和1种Bphe,而在光照好氧条件下,能够积累1种BChl a和2种Bphe。而本研究表明:在无添加NaCl的光照条件下,菌体只积累1种BChl a和1种Bphe,随着NaCl升高,BChl a相对含量逐渐降低,又积累了另外1种Bphe,这2种Bphe相对含量逐渐增加,与光照好氧条件下积累两种Bphe的现象一致。由于紫细菌中积累的4种BChl a或4种Bphe的吸收光谱基本一致,究竟积累哪种BChl a和Bphe还有待于进一步研究。
Rba.capsulatus XJ-1分离自盐碱环境,具有耐盐性,而APB积累的光合色素是环境调控和细胞内生理代谢的综合体现,由此,我们认为在NaCl环境中,菌株XJ-1大量合成和积累BPhe与其环境适应性有关,光合色素对NaCl的响应机制还有待于进一步研究。
参考文献:
[1] 杨素萍,林志华,崔小华,等.不产氧光合细菌的分类学进展[J].微生物学报,2009,48(11):1562-1566.
