单核细胞增多性李斯特菌 （Listeriamonocytogenes，LM），是近 20 年来才逐步被人们认识的一种人兽共患疾病的致病菌。 其在 4 ℃下可生长繁殖并污染食品继而感染人类，感染后发病死亡率约为 25%,WHO 将其列为 20 世纪 90 年代食品中四大致病菌之一，也被列为 21 世纪对中国人卫生健康具有重大影响的 12 种病原微生物之一。 近年来，国内外报道从多种食品中分离到李斯特菌或食品污染李斯特菌而引起的食物中毒暴发事例，为此单增李斯特菌成为新的重要的食源性疾病病原菌， 已引起了食品卫生管理部门的广泛关注，许多国家均加强了对该菌的检测及研究工作。
自 1996 年以来， 新疆先后有 5 个地区的 3 个牧区、4 个农区养羊场暴发以神经症状为主要特征的李氏杆菌病，造成 1300 余只羔羊死亡。 学者们从采集病死绵羊的脑和肝、脾等进行病原菌分离，分离得到 LM90 株， 运用多重 PCR 方法确定 LM90为 4b 血清型。 目前 LM 有 16 个血清型，其中 1/2a、1/2b、4b 血清型是 LM 致病菌株最主要的血清型，研究表明，来自食品和患者的 95%分离株都属于这此3 个血清型。
本实验以单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b 血清型菌株 LM90 为实验菌株， 对 LM90 菌株的5 个毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 进行了克隆和序列分析，旨在了解 LM90 与其他的 LM 4b 的 5个毒力基因的差异， 推测羊源的 LM90 感染人的可能性。
1、 材料与方法
1.1 材料
单增李斯特菌 LM90 菌株，DH5α 由本实验室保存，PMD-19T 载体，sfil 和 pvul 限制性内切酶购自宝生物公司，质粒 DNA 小剂量制备试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒购 自 Novengy 公 司 ；Buffer，DNTP，Taq 酶 ，Marker2000，Marker5000 购 自北京东盛公司；脑心浸液培养基购自青岛高科技园海博生物技术有限公司，琼脂购自 Biotopped 公司，琼脂糖购自 Biowest 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计合成
参照 Genbank 中公布的单增李斯特菌 F2365基因全长序列 （登陆号为 AE017262）， 用 Primer5.0 软 件 设计 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 基 因 引物（表 1），引物由华大基因公司合成，测序由上海生工完成。
1.2.2 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 基因片段的克隆用裂解法提取 LM90 的 DNA， 以提取的 LM90的 DNA 为模板，PCR 扩增 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 基因。其反应体系为：10×buffer（含 MgCl2）3 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，上游引物（25 mmol/L）1 μL，下游引物（25 mmol/L）1 μL，TaqDNA 酶(2.5 U/mL)1 μL，模板 2 μL， ddH2O 21 μL，总体积 30 μL。反应条件如下：95 ℃ 3min；94 ℃ 50s；70 ℃（Auto 为 68 ℃ ，InlJ 为 69 ℃ ） 45 s；72 ℃ ，3 min（InlB，InlC 为 90 s）；72 ℃，10 min；4 ℃保存。
PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测， 将 PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收 试剂盒回 收后，与PMD-19T 连接，连接体系为：PMD19-T 0.5 μL，PCR回收产物 4.5 μL，solutionI 5 μL，4 ℃过夜连接。取过夜连接产物 10 μL， 加入到 100 μL 的 E.coli DH5α 感受态细胞中，冰浴 30 min，42 ℃热 击60s，冰浴 2 min，加入 800 μL 的液体 LB，放置在 37 ℃摇床中，摇菌 1 h，5000 r/min，离心 2 min，弃出 800μL 上清，混匀，涂到含有 Amp（100 μg/mL）的 LB 平板上，37 ℃过夜培养。
挑取过夜培养的单个菌落， 分别放置于含有Amp（100 μg/mL）的液体 LB 中，37 ℃摇菌，3 h 后，以菌液为模板，进行 PCR 的筛选鉴定和限制性内切酶的鉴定。然后将筛选的阳性质粒送交上海生工进行序列的测定， 并采用 DNAMAN 软件对其进行序列分析。
2、 结果与分析
2.1 LM90 株 Ami、Auto、InlB、I nlC、InlJ 基因的扩增用相对应的引物分别对 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 基因进行 PCR 扩 增 ，PCR 产 物经 1%琼 脂糖凝胶电泳得到与预期值相符的目的片段，片段长度依次为 2244、2304、1140、891、2508 bp(图 1)。
2.2 LM90 株 Ami、Auto、InlB、I nlC、InlJ 基因的克隆目的基因经 DNA 凝胶回收试剂盒回收后和PMD19-T 载体连接， 连接产物转化 DH5α 感受态细胞， 分别挑取重组质粒 PMD19-T-Ami、PMD19-T-Auto、PMD19-T-InlB、PMD19-T-InlC、PMD19-T-InlJ 单个白色菌落，增菌培养 1-2 h，分别用相应的引物对目的基因进行菌液 PCR 扩增， 经 1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，对阳性菌提取质粒，用限制性内切酶 sfil 和 pvul 对阳性质粒做酶切鉴定（图 2）。
2.3 LM90 菌 株毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 核苷酸及推导的氨基酸的序列分析用 DNAMAN 软件对序列进行分析，LM90 菌株毒力基因 Ami 与 Genbank 中公布的参考株 F2365的 Ami 基因的核苷酸序列同源性为 98.04%， 序列分析显示该基因共有 6 处发生了碱基突变， 分别是：第 183 位核苷酸由 C 突变为 T，第 228 位核苷酸由 T 突变为 C，第 552 位，第 1145 位核苷酸由 A突变为 G，第 1515 位核苷酸由 T 突变为 A，第 1659位核苷酸由 G 突变为 A。 Ami 编码 747 个氨基酸，推导氨基酸序列的同源性达到 99.73%。氨基酸序列有 6 处发生突变，其中 4 处是同义突变，2 处是错义突变， 错义突变的是第 360 位氨基酸由 Tyr 突变为Cys，第 483 位氨基酸由 Phe 突变为 Leu。
LM90 菌 株毒力基因 Auto 与 Genbank 中 公布的参考株 F2365 的 Auto 基因的核苷酸序列同源性为 96.59%，序列分析显示该基因共有 4 处发生了碱基突变，分别是：第 448 位核苷酸由 A 突变为 C，第630 位核苷酸由 T 突变为 C，第 1258 位核苷酸由 A突变为 G，第 1825 位核苷酸由 C 突变为 T。 Auto 编码 774 个氨基酸， 推导氨基酸序列的同源性达到99.61%，氨基酸序列有 4 处发生突变 ，其中 2 处是同义突变，3 处是错义突变， 错义突变的是第 83 位氨基酸由 Glu 突变为 Asp， 第 144 位氨基酸由 Leu突变为 Pro，第 414 位氨基酸由 Asp 突变为 Val。
LM90 菌株毒力基因 InlB 与 Genbank 中公布的参考株 F2365 的 InlB 基因的核苷酸序列同源性为98.20%，序列分析显示该基因共有 1 处发生碱基突变， 第 656 位核苷酸由 T 突变为 G。 InlB 编码 379个氨基酸， 推导氨基酸序列的同源性达到 99.74%，氨基酸序列有 1 处错义突变， 第 206 位氨基酸由Trp 突变为 Gly。
LM90 菌株毒力基因 InlC 与 Genbank 中公布的参考株 F2365 的 InlC 基因的核苷酸序列同源性为96.41%，序列分析显示该基因共有 4 处发生了碱基突变，分别是第 63 位，第 208 位，第 856 位核苷酸由 T 突变为 C，第 673 位核苷酸由 T 突变为 A。 InlC编码296 个氨基酸， 推导氨基酸序列的同源性达到99.66%，氨基酸序列有 4 处突变 ，其中 1 处是同义突变，3 处是错义突变， 错义突变的是第 11 位氨基酸由 Val 突变为 Ala，第 116 位氨基酸由 Lys 突变为Asn，第 126 位氨基酸由 Val 突变为 Met。
LM90 菌 株毒力基因 InlJ 与 Genbank 中 公布的参考株 F2365 的 InlJ 基因的核苷酸序列同源性为 98.23%，序列分析显示该基因共有 4 处发生了碱基突变， 分别是第 591 位核苷酸由 A 突变为 T，第658 位核苷酸由 G 突变为 A，第 1404 位核苷酸由 C突变为 T，第 2348 位核苷酸由 T 突变为 C。 InlJ 编码 835 个氨基酸， 推导氨基酸序列的同源性达到99.76%，氨基酸序列有 4 处 突变 ，其中 2 处 是同义突变，2 处是错义突变，错义突变的是第 189 位氨基酸由 Asn 突变为 Asp， 第 752 氨基酸由 Ser 突变为Phe。
3、 讨论与小结
单增李斯特菌4b血清型主要有 F2365、clip80459、LL195、J1-220、J1816、07PF0776 六种，其中 LL195、clip80459、07PF0776 是从人类的临床病例中分离出来的， F2365、J1816、J1-220 是从食品中分离出来的，通过比较其他 5 株菌的毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ， 得出 F2365 与其他5 株菌 （LL195、J1816、clip80459、J1-220、07PF0776）的同源性均为 99%~100%。 序列比对说明单增李斯特菌 4b 血清型的这 5 个毒力基因序列相对保守，不同源的 4b 血清型菌株之间的变异较小。 由于单增李斯特菌 4b 血清型的 5 个毒力基因比较保守，本研究以 F2365 菌株作为参考，研究了与单增李斯特菌粘附侵袭相关的毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 的变异情况。
Ami、Auto 基因编码具有自溶作用的蛋白，该蛋白包括信号肽区，N 端催化域 （Ami） 和自溶区（Auto），C 端由 GW 区组成。 N 端区域能特异性的识别细胞壁上的肽聚糖， 从而破坏细菌细胞壁，GW 区使细菌粘附至靶细胞表面。 LM90 株 Ami第 483 位氨基酸在 GW 区有 1 个错义突变的氨基酸，由 Phe 突变为 Leu。 Auto N 端有 2 个错义突变氨基酸，第 83 位氨基酸由 Glu 突变为 Asp，第 144位氨基酸由 Leu 突变为 Pro，C 端在其 GW 区有 1个错义突变氨基酸，第 414 位氨基酸由 Asp 突变为Val。
InlB、InlC、InlJ 是 LM 内化素家族的成员，该类蛋白主要参与细菌的侵袭，粘附。 内化素蛋白 N 端均有 LRR 重复区，C 端差异比较大，InlB C 端为GW 区，InlC 没有 GW 区， 只有 5 个连续的 LRR 重复区，InlJ C 端为 LPXTG 基元。 LRR 重复区参与细菌的粘附和信号的传递，LPXTG 基元能使蛋白质结合到宿主细胞的胞浆膜上。 LM90 株 InlB 错义突变的氨基酸不在它的这些功能区域，InlJ 错义突变的氨基酸位于它的 C 端的细胞壁锚定区， 第 752氨基酸由 ser 突变为 phe，InlC 在 LRR 区有 2 个氨基酸的错义突变， 分别是第 116 位氨基酸由 Lys 突变为 Asn，第 126 位氨基酸由 Val 突变为 Met。
本研究通过对 LM90 毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ PCR 扩增， 测序， 并将序列提交到 NCBI上，登录号分别为 KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612。 将序列与 F2365 进 行比对 ，核苷酸的同源性高达 96%， 氨基酸的同源性高达99%。 证明毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 序列保守，氨基酸序列的错义突变有部分位点位于它的功能位点上， 对于 LM90 毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ 功 能位点个别氨基酸的突变是否会影响其粘附，信号传递，侵袭等功能还有待于进一步研究。 有报道称人食用了被 F2365 菌株污染的食物，引发了人的李斯特菌病的爆发，出现败血症，脑膜炎，肠炎等症状，而羊源的 LM90 菌株与食源性的F2365 菌株的同源性较高， 推测 LM90 菌株也存在着感染人并引发人的李斯特菌病。
