摘 要： 登革病毒(dengue virus,DENV)是流行于世界范围内的重要虫媒病毒之一,近年来其传播范围的不断扩大给疾病防控带来了极大困难。反向遗传学技术作为一种重要手段,广泛应用于RNA病毒的相关研究,自1991年第1次成功构建DENV感染性克隆以来,明显加速了DENV相关领域的研究。本文总结了DENV反向遗传学技术的构建策略及技术突破,为DENV致病机制研究及疫苗研发提供新思路。
关键词： 登革病毒; 反向遗传学; 感染性克隆; 嵌合疫苗;
Abstract： Dengue virus is one of the most important arboviruses in the world. In recent years,the continuous expansion of its spread has brought great difficulties to disease prevention and control. As an important tool,reverse genetics technique has been widely used in RNA virus-related research. Since the first successful construction of dengue virus infectious clones in 1991,the research in dengue virus-related fields has been greatly accelerated. This article reviews the construction strategies and technological breakthroughs of dengue virus reverse genetics technique,and provides new ideas for the research on the pathogenic mechanism and vaccine of dengue virus.
Keyword： Dengue virus; Reverse genetics; Infectious clone; Chimeric vaccine;
登革病毒（dengue virus,DENV）是一类经蚊媒叮咬传播并引起登革热（dengue fever,DF）、登革出血热（dengue hemorrhagic fever,DHF），甚至危及生命的登革休克综合征（dengue shock syndrome,DSS）的虫媒病毒。WHO报道，全球约一半人口存在DENV感染风险[1]。我国广东省每年均呈现多地暴发，2005～2017年已报道4.5万感染病例，2019年6月深圳市已有相关病例报道，严重威胁人类健康和公共卫生安全[2]。
DENV属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），分为DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4四个血清型。病毒基因组为单股正链RNA，含有1个开放阅读框，编码产生3种结构蛋白（C、prM和E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。5′和3′末端各有一段非翻译区（untranslated region,UTR），存在多种二级结构和保守序列，主要参与病毒RNA复制的调节。5′末端具有Ⅰ型甲基化帽结构（m7G5′ppp5′A),3′末端无多聚腺苷酸尾。
反向遗传学技术是直接从生物的遗传物质入手来研究生物表型变化的一门技术。由COLTER等在1957年首次应用[3]。目前已通过该技术获得多种正链RNA病毒的感染性克隆，为病毒感染机制等重要特性的研究开创了新的时代。1991年，LAI等[4]首次将反向遗传学技术应用于DENV的研究并成功构建出第1个DENV-4型感染性克隆。随后各实验室陆续开始不同型别DENV感染性克隆的构建，并试图从基因水平探索病毒毒力及感染机制等。然而，利用该技术获得重组DENV仍存在诸多难点，尤其是DENV-3型，病毒序列在宿主细胞中的不稳定性和细菌毒性等常使病毒cDNA全长克隆发生随机突变[5,6]。本文介绍了通过反向遗传学技术研究DENV的主要流程及技术难点，并对反向遗传学技术在DENV中的研究现状作一综述，旨在为DENV的致病机制研究及DF疫苗的研发提供参考。
1 、DENV反向遗传学技术的构建策略
1.1、 DENV全长cDNA的构建
为方便研究，人为地将反向遗传学技术分为病毒全长cDNA的构建、感染性RNA的体外转录、转染和恢复病毒的表型鉴定等步骤。在DENV的反向遗传学研究中，获得高保真的病毒全长cDNA是最关键的一步，直接影响恢复病毒的基因序列及表型。获取病毒全长cDNA的方法主要有传统的感染性克隆技术和长链PCR等新型技术。
1.1.1 、感染性克隆技术
感染性克隆技术是将病毒基因组cDNA克隆至相应克隆载体中，再通过体外转录RNA或直接转染敏感细胞来获得具有感染真核细胞能力的病毒，在DENV的反向遗传学研究中应用最为广泛。但此过程通常会在病毒基因组3′末端人为引入酶切位点，使获得的病毒序列不能忠实于母本序列。研究者通常在cDNA 3′末端后添加丁型肝炎病毒核酶序列，核酶序列在细胞内完成自切割以去除额外引入的非病毒基因组序列[7]。此外，DENV cDNA全长约11 000 bp，而大多数质粒载体理论上仅可容纳<10 000 bp片段，目的片段过长将限制质粒复制，或引起目的片段的碱基丢失或突变，影响片段的稳定性。对此，早期常采用构建亚克隆的方法，先将cDNA全长分解为不能编码完整蛋白的短片段，分别构建至克隆载体中，再将各片段逐一拼接，最后连为全长cDNA克隆。有研究者将病毒cDNA全长分为2段并分别克隆至质粒载体中，再经双酶切获得2个cDNA线性片段，通过体外定向连接获得线性cDNA全长[4,5]。虽然该方法可克服病毒cDNA全长克隆的不稳定性，但cDNA线性片段连接效率低，获得的转录模板产量低，且操作耗时费力。目前主要尝试多种不同克隆载体、宿主载体以获得稳定的全长cDNA序列。
1.1.1.1、克隆载体的选择
根据拷贝数不同，质粒分为高拷贝、中拷贝和低拷贝。为方便操作，提高效率，DNA克隆中会优先选择高拷贝质粒。但DENV基因组中存在毒性序列、短串联重复序列、原核启动子元件等，会产生毒性蛋白，使用高拷贝质粒易引入碱基的插入、缺失或置换突变，且突变序列多为大肠埃希菌基因组的同源序列，即便能够利用高拷贝质粒获得感染性克隆，其生长速率也会非常慢，不利于后续操作[6,8]。大量研究报道，DENV cDNA全长克隆至低拷贝质粒中更稳定。GUALANO等[9]将DENV-2病毒cDNA分段克隆至低拷贝质粒pDVWS310中，成功转录出感染性病毒RNA。类似的方法也成功用于构建其他不同DENV-2毒株的感染性克隆[10,11]。尽管如此，某些DENV-3毒株仍无法用低拷贝质粒获取稳定、完整的cDNA序列。细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）是能够容纳高达350 000 bp外源插入片段的环状DNA分子，拷贝数极低，在一定程度上可降低DENV感染性克隆对宿主菌的毒性，代替质粒用于感染性克隆的构建。MOSIMANN等[12]通过将DNEV-3病毒基因组克隆至BAC中，成功获得了病毒全长cDNA。有研究报道，通过该方法同样可以获得DENV-1和DENV-2病毒全长cDNA[13,14]。
1.1.1.2、宿主载体的选择
原核和真核细胞中均有报道可成功获取DENV感染性克隆。大肠埃希菌是最常用的原核细胞表达系统。有研究显示，4种血清型相关株型DENV的感染性克隆均能够在不同基因型大肠埃希菌中稳定传代复制[4,15,16]。真核细胞通常比细菌更耐受DENV的毒性序列，对于无法在大肠埃希菌中稳定复制的DENV已被成功克隆至真核系统中，其中酿酒酵母应用最广。在酵母中构建感染性克隆的两种常用策略分别为酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）和酵母-大肠埃希菌穿梭载体，其中穿梭载体方法较YAC方法更简单、可靠，可直接在酵母细胞内通过同源重组连接病毒cDNA全长。POLO等[10]通过穿梭载体的方法在酵母中构建了DENV-2全长cDNA。随后有报道用该方法获得了DENV-3、DENV-1和DENV-4全长cDNA[17,18,19]。
1.1.2 、新型反向遗传学技术
感染性克隆的应用解决了大部分DENV的cDNA制备，但有些DENV仍无法获取稳定、高保真的cDNA序列。随着分子生物学技术的不断进步，不依赖于载体、宿主菌的病毒全长cDNA获取方式不断被发现，如长链PCR技术、无缝连接技术等，为DENV反向遗传学研究提供了新的技术方法。
随着多种聚合酶保真度的提高和反应条件的优化，长链PCR技术和无缝连接技术等广泛应用于DENV全长cDNA制备，极大地缩短了时间，提高了实验效率。GRITSUN等[20]通过长链RT-PCR直接扩增病毒全长cDNA，此外，又通过将2个具有同源臂的扩增片段进行融合PCR获得病毒全长cDNA;GOVINDARAJAN等[21]也利用长链PCR技术成功构建了多株黄热登革嵌合病毒（chimeric yellow fever dengue,CYD）。SIRIDECHADILOK等[22]利用Gibson无缝连接技术高效快速地完成了多个DENV重叠PCR片段的正确连接，并利用引物末端人工加入的真核启动子CMV，直接将连接产物转染细胞获得DENV恢复病毒。此外，AUBRY等[23]开发了感染性亚基因组扩增子技术（infectious-subgenomic-amplicons,ISA），用已有病毒基因库为模板，将病毒全长cDNA分为3段进行扩增，每个片段含有70～100 bp的重叠区域，并且第1个和最后1个片段分别在5′和3′末端添加CMV启动子和丁型肝炎核酶序列，再将PCR产物混合后直接转染敏感细胞，从而收获感染性病毒，该方法已成功用于DENV的拯救。
1.2、 感染性RNA的体外转录和转染
感染性RNA的体外转录技术发展已经比较成熟，Promega、Roche等公司均有商业化试剂盒上市。需要注意的是，天然DENV基因组5′末端存在Cap结构，该结构既增加了病毒的感染能力，又提高了RNA末端的稳定性。但体外转录获得的RNA其5′末端无Cap结构。因此，在转录体系中需人工加入m7G Cap Analog，利用模板cDNA 5′末端的噬菌体启动子SP6或T7，体外转录产生加帽的正链RNA病毒。
感染性RNA进入宿主细胞的方式及转染细胞的选择是反向遗传的又一个关键步骤，直接影响恢复病毒的拯救。最早有研究者将DENV的RNA转录产物直接注射至动物体内以产生恢复病毒，但由于动物实验不可控因素较多，转染病毒敏感细胞仍是目前常用方法。常用的转染方法包括脂质体法和电穿孔法，钱锋等[24]研究发现，两种方法的转染效率无明显差异，虽然脂质体转染操作更方便，但电穿孔法使用的细胞范围更广、转染时间更快、无潜在的细胞毒性，在使用中可通过优化电击参数及电转缓冲液最大限度地提高转染效率。多位学者均通过电转染的方式成功获得了多种型别的重组DENV[25,26,27]。对于转染细胞的选择，病毒的敏感性、恢复病毒的拯救效率及后期应用等均是需要考虑的因素。BHK-21、C6/36、LLC-MK2和Vero细胞等均为DENV RNA转染常用细胞。DE BORBA等[28]和CHEN等[29]通过转染C6/36细胞，相继成功获得DENV-1恢复病毒和DENV-4/3嵌合病毒。YANG等[30]通过转染PHK细胞，成功制备了JEV/DENV-1嵌合病毒。ZHU等[11]及SANTOS等[17]以BHK-21为转染细胞获得了DENV-3和DENV-2恢复病毒。由于BHK-21细胞是无限传代细胞，具有潜在致瘤性，仅供科研使用。Vero细胞作为WHO和《中国生物制品规程》认可并推荐用于疫苗生产的细胞系，具有可连续传代、遗传稳定、生长快、对DENV敏感且病毒增殖滴度高等优点，赛诺菲巴斯德、日本武田制药等机构已通过电转染的方式将其用于登革嵌合疫苗的反向遗传学研究中[31,32]。
1.3 、恢复病毒的表型鉴定
表型鉴定是验证恢复病毒与母本病毒是否具有相似生物学特性的重要手段。病毒表型主要由共有序列和突变谱共同决定。突变谱是指RNA病毒的“异质性”，即由于真核细胞体内的RNA聚合酶缺乏核酸酶活性，导致病毒RNA复制过程中出现错配而产生混合病毒群体。反向遗传学方法获得的恢复病毒仅保留了母本病毒中的共有序列，不能保留原始病毒样品中已存在的突变谱。此外，利用SP6/T7进行体外转录的过程中，易引入不同于原突变谱的随机突变，可能改变恢复病毒的表型[33]。因此，感染性RNA及恢复病毒的表型鉴定对DENV反向遗传学平台的稳定性评价具有重要意义。通常是将感染性RNA转染细胞后，观察细胞病变、蚀斑大小或通过免疫荧光技术检测DENV蛋白表达等鉴定恢复病毒是否与母本病毒具有相同表型。实验中可将DNA酶和RNA酶处理后的转录产物作为对照，以验证用于转染的RNA来源并忠实于模板序列。此外，还可在cDNA模板中人为引入遗传标记。恢复病毒的生长动力学特征、宿主范围以及在动物模型中的毒力研究、免疫原性研究等，均应与母本病毒的表型相比较来进行鉴定。
2 、DENV反向遗传学技术的应用
自反向遗传学技术成功用于DENV拯救后，DENV在不同领域的研究均取得了迅速发展。目前可通过对DENV进行定点突变、缺失、插入或重排等，以研究其致病基因、病毒复制、基因功能、宿主与病原体间的相互作用、疫苗及抗病毒药物的研发等。
2.1、 反向遗传学技术与DENV致病机制
DENV非结构蛋白主要参与病毒RNA的复制及组装。近年来，有研究报道NS1、NS4B和NS5相关基因的改变均可引起DENV致病性的改变。CRABTREE等[34]构建了DENV-2的全长感染性克隆，并通过定点突变发现糖基化位点NS1-130N和NS1-207N分别缺失或联合缺失均可降低DENV在C6/36细胞中的复制能力，同时也显着降低对小鼠的神经毒力，提示DENV-2 NS1蛋白上的糖基化可能会影响病毒的致病性。GRANT等[35]制备了DENV-2强毒株D2Y98P-PP1的感染性克隆，引入NS4B(F52L）的单个氨基酸突变后发现病毒的RNA合成显着降低，并且完全丧失了对AG129小鼠的致病力。随后对DENV-2弱毒株TSV01的NS4B相同位点进行了反向突变后，毒力明显增强，提示NS4B的第52位氨基酸是DENV-2的关键毒力位点。HANLEY等[36]将DENV-4 814669株NS5基因中连续的80个带电荷氨基酸分别突变为不带电荷的丙氨酸，构建出32个重组突变病毒中，有19个突变病毒在乳鼠脑内复制能力增强，3个突变病毒可显着抑制其在乳鼠脑内的复制能力，这对重组减毒活疫苗的研发有重要意义。
E蛋白是DENV最大的结构蛋白和主要的包膜蛋白，在病毒侵染细胞过程中发挥重要作用。BUTRAPET等[37]构建了DENV-2 16681株的多个点突变感染性克隆质粒，通过体外转录、电转染Vero和C6/36细胞，成功获得突变病毒，并发现DENV-2的E蛋白铰链区内的E52、E54、E133位氨基酸突变后会影响病毒与宿主细胞的融合能力，从而降低病毒的感染性。DE WISPELAERE等[38]通过PCR扩增和酵母重组的方法获得了DENV-2 NGC突变株病毒，发现E蛋白结构域Ⅰ/结构域Ⅲ接头处的E-G296A、E-S298A、E-Y299F 3个保守氨基酸的突变可显着抑制病毒的装配。
病毒UTR内含有多种保守的RNA二级结构，主要指导病毒的复制。LEARDKAMOLKARN等[39]在DENV-2 16681感染性克隆的基础上，通过PCR技术在5′UTR的第14、15、57位核苷酸处引入定点突变，发现这3个位点的改变会降低病毒复制能力，减弱病毒对乳鼠的神经毒力。此外，有报道显示，不同型别DENV的3′UTR和5′UTR中引入缺失突变后，均可导致病毒毒力减弱[40,41]。这些通过反向遗传学技术将突变引入DENV全长cDNA中，观察毒力改变，从而鉴定DENV关键毒力位点，为解释DENV复制机制、减毒机理及其相关功能的研究奠定了理论依据。
2.2、 反向遗传学技术与DENV嵌合疫苗
疫苗接种是预防DF最经济有效的手段，反向遗传学技术为DF疫苗的研制开辟了新途径。四价嵌合疫苗目前是临床试验中应用最多的DF疫苗，也是最有前景的疫苗之一。该类疫苗以减毒株作为骨架病毒，通过将其结构蛋白prM-E基因替换为目的基因获得表达目的基因结构蛋白的嵌合体病毒。其中巴斯德公司研发的CYD-TDV是全球唯一批准上市的DF疫苗，也是第一款获得美国FDA批准的DF疫苗。美国NIH研发的LATV△30和日本武田公司研发的DENV ax均处于临床试验阶段。
CYD-TDV疫苗是以世界公认安全的黄热疫苗株YF17D为骨架，通过反向遗传学技术将DENV-1、2、3、4型的prM-E基因替换掉YF17D的相应结构蛋白基因研制而成。临床前及临床Ⅱ期试验结果表明，该疫苗遗传稳定，且耐受性和安全性较好[42]。但在临床Ⅱb及临床Ⅲ期试验中发现，不同个体对4种血清型的DENV表现出不均衡的保护反应，对Ⅲ型和Ⅳ型DENV的保护率为75%，Ⅰ型为50%，但对Ⅱ型病毒效用仅为35%[43]。美国NIH研发的四价登革嵌合疫苗LATV△30(TV003/TV005），其中rDENV1Δ30、rDENV3Δ30和rDENV4Δ30是通过反向遗传学技术删除了DENV-1、3、4型3′末端非编码区中的30个核苷酸以达到减毒目的，rDENV2则是以rDENV4Δ30为骨架将其prM-E基因替换为DENV-2 NGC株相应基因而达到减毒目的。目前已进入Ⅲ期临床试验阶段，仅1次免疫后即可在受试者体内检测到较高的四型血清阳转率，高达74%～92%(TV003）和90%(TV005)[44]。日本武田制药公司研发的DENV ax，是以DENV-2型减毒株PDK53为骨架，分别将1、3、4型DENV减毒株的prM-E基因进行嵌合替换研制而成，也已进入Ⅲ期临床试验，表现出良好的安全性和免疫效果[45]。此外，有文献报道，DENV骨架病毒的非结构蛋白能诱导机体产生CD8+T细胞，可针对其他型别DENV发挥细胞免疫应答[46]。
3、 结语
随着世界人口流动性的增大，DENV传播区域不断扩增，加剧了病毒对全球人类健康的危害。尤其近年来我国广东、云南等地DF疫情的频繁爆发更是令人担忧。反向遗传学技术的出现对研究DENV的致病机制、疫苗开发提供了强有力的手段。感染性克隆的产生是反向遗传学技术发展的关键一步，多年来不同型别DENV感染性克隆的成功构建为DENV的深入研究积累了大量技术储备。并且，随着基因合成的普及、新型DNA连接技术和高保真PCR扩增技术的发展，许多新型方法不断引入至反向遗传学技术中，为其提供了更容易、更快速、更可靠的方法来揭示DENV研究中的科学问题。然而反向遗传学技术也存在一定的安全风险，多种新型登革嵌合病毒的出现，如YFV/DENV、TBEV/DENV、JEV/DENV等，可能带来潜在的生物安全风险，科研工作者应合理利用反向遗传学技术，在技术可控的范围内推动科学技术的进步。
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