复合人工骨对兔骨缺损的修复作用

　　骨髓基质干细胞作为一类未分化的细胞，其具有自我复制能力，能够分化成为至少一种功能细胞的早期未分化细胞[1].目前绝大多数学者认为，组织工程包含的三个核心因素是：干细胞，适合的生物支架和生长因子。骨组织工程的先决条件是有足量的成骨潜能的细胞。骨髓基质干细胞具有以下特点：（1）具有向多种组织类型分化的潜能，可以在体外大量扩增；（2）取材方便且对机体损害轻微，在进行移植时由它诱导的组织不存在免疫排斥和组织配型反应[2];（3）植入外源性基因不影响其生理特性，所以它成为当今骨组织工程的最理想种子细胞。由于绿色荧光蛋白分子相对较小（2 619 kD），可以与很多蛋白融合表达而对各自性质的特性几乎没有影响，因而利用标准亚克隆技术即可将感兴趣的基因与GFP融合后转入感兴趣的生物体内进行瞬间或稳定表达，这样可进行细胞间的物质运输、运输的动力、活体定位观察及蛋白质定位学的研究[3].本实验拟通过体外培养兔骨髓基质干细胞，体外转染绿色荧光蛋白，证明其在正常细胞中可存活。我们建立了一种复合骨组织人工骨的材料，同时采用骨组织工程复合材料学方法，以异体骨髓基质干细胞（Mesenchymal stem cells MSCs）为种子细胞，制成细胞-载体复合物，用来修复兔桡骨骨缺损，检查修复情况。

　　1资料和方法。

　　1.1一般资料。BM-Ⅱ型水浴式生物组织包埋机（Olmpus,日本），1512型组织切片机（WMK-08,山东潍坊医疗器械厂，潍坊），水浴式自动恒温摊片器（TD5A-WS,湘仪，北京），WP700L17型微波炉（SW-CT-1FD,北京大杨傲飞实验室设备有限公 司，北 京），Leica quantimet 500图 像 分 析 仪（1X70,Olmpus,日本），Toshiba KXO15 R型X线机（FA2104,上海衡平仪器仪表厂，上海），Siemensplus 4螺旋CT机，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原多克隆抗体：武汉博士得生物制品有限公司产品。SABC免疫组织化学试剂盒：由武汉博士得生物制品有限公司提供，包括正常血清封闭液、二抗、SABC、抗原修复液和复合消化液。HE染液，Modified tetrachrome染液。

　　1.2试验动物分组选用健康成年中国大白兔72只，重2.0~2.5 kg,雄雌不限，随机分为实验组（A组），对照组（B,C组），每组24只。A组行同种异体骨髓基质干细胞骨移植，B组行自体骨移植，C组行空白支架。

　　1.3手术方法速眠新5 ml/kg耳缘静脉麻醉后，仰卧位固定，术区剪毛，碘伏酒精消毒，铺洞巾。取右侧前肢中段桡侧骨凸起处做约3.0cm纵形切口，逐层切开，保护血管、分离软组织后显露桡骨。在距桡骨远端2.0cm处用线锯截断桡骨，再向近端距第1截骨线1.0cm处做第2截骨线，切除1.0cm骨段，A组植入同种异体基质干细胞复合物、B组原位植入自体骨，C组植入支架，彻底止血、冲洗后依次缝合筋膜与皮肤，无菌敷料绷带包扎。术后肌注青霉素针剂每次50万单位，1次/d,连续5 d,在相同条件下用标准饲料分笼饲养。由于兔前肢的上下尺桡关节先天性骨性融合，桡骨离断后尺骨可发挥很好的支撑作用，故骨折端稳定性好，不需要内外固定。术后4周、8周、12周分批取材进行拉伸应力实验、X线片和HE染色以及内源性BMP-2表达情况的检查，然后作对比分析。

　　1.4标本处理。分别于术后4、8、12周分3批，每组各随机抽取8只动物，先行拍摄X线片，然后用气体栓塞法处死，于右侧前肢桡骨骨折端取材（切取以骨折端为中心2cm的骨段）。肉眼大体观察后用生理盐水冲洗，立即置于4%多聚甲醛溶液，在室温下固定24~48 h.置于福尔马林100 ml、生理盐水800 ml、甲酸70 ml、盐酸80 ml、三氯化铝60 g、乙酸25 ml配成的混合脱钙液中1周，至脱钙满意后，梯度酒精脱水，叔丁醇透明，石蜡包埋，5μm厚度组织切片，行HE染色及免疫组织化学染色观察。

　　1.5放射学检查每只动物均由专人负责拍摄右侧前肢正侧位X线片，进行观察和对比。摄片条件：30 mA、50 kV、0.05S[6].

　　1.6拉伸应力实验。国标拉力机下行10 mm/s拉伸实验，记录产生断裂时的最大拉力值，然后将各组进行比较。

　　1.7光镜观察。光镜下观察HE染色切片，比对组织学变化。

　　1.8免疫组化观察。比较3组生物因子BMP-2表达情况。生物因子的表达情况经计算机图像分析系统处理后用平均灰度值来表示。

　　1.9统计学处理平均灰度值用均数标准差表示，使用统计学软件SPSS 14.0进行配对t检验，3组比较，P<0.05.

　　2结果。

　　2.1放射学检查。

　　实验A组：术后4周时骨缺损处有低密度组织阴影出现，骨折端有新生骨痂出现；术后8周骨痂量增多，且其骨密度增加，部分骨缺损已经达到临床愈合；术后12周骨痂量明显增多，且密度接近正常骨密度，出现骨髓腔结构，髓腔再通。

　　对照B组：术后4周时骨折端有低密度组织阴影出现骨折端有新生骨痂出现，骨折线明显模糊；术后8周骨痂量增多，且其骨密度增加密度接近正常骨密度，出现骨髓腔结构；术后12周已经达到临床骨愈合，髓腔再通。对照C组：术后4周时无骨痂形成，骨折边缘光滑；术后8周骨折边缘趋向模糊，无明显骨痂形成；术后12周骨折边缘模糊，少量骨痂形成。