本方由制何首乌、淫羊藿、菟丝子、虎杖、川芎、白芍6 味中药组成 , 制何首乌为方中君药 , 具有补肝肾 , 益精血 ,乌须发 , 强筋骨的作用。所含主要有效成分为 2, 3, 5, 4’-四羟基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷 ( 以下简称 ：二苯乙烯苷 ), 该化合物具有广泛的心血管活性 , 免疫调节 , 保肝作用等 , 因而常作为何首乌质控指标成分。故选择二苯乙烯苷作为定量分析成分 , 以保证制剂的质量。通过试验及参考有关研究文献 , 建立了高效液相法 , 测定本制剂中二苯乙烯苷的含量。
1材料与方法
1. 1材料 惠谱 1100- 型高效液相色谱仪 ；紫外 Model 500检测器 ；色谱柱为色谱柱 ：Luna 5 μm, C18(2), 250×4.60 mm100 A ；AB135-S 电子天平 ；Model C3860A 超声波仪 ( 上海超声仪器厂 )。六味首乌颗粒 ( 批号 ：20050511, 内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司 ) ；二苯乙烯苷标准物质 ( 含量测定用批号 ：110844-200404, 中国食品药品检定研究院 )。甲醇为色谱纯 ,磷酸为分析纯 , 纯净水 ( 娃哈哈 )。
1. 2方法
1. 2. 1色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ；甲醇 -0.2% 磷酸溶液 (29∶71) 为流动相 ；检测波长为 320 nm。理论板数按 2, 3, 5, 4’- 四羟基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷峰计算应不低于 3000。
1. 2. 2对照品溶液的制备 精密称取 2, 3, 5, 4’- 四羟基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷对照品适量 , 加 50% 甲醇溶解制成每 1 ml 含 20 μg 的溶液 , 即得。
1. 2. 3供试品溶液的制备 取本品内容物适量 , 研细 , 取约0.3 g, 精密称定 , 置具塞锥形瓶中 , 精密加入 50% 甲醇 50 ml,密塞 , 称定重量 , 超声处理 ( 功率 300 W, 频率 40 kHz)30 min,放冷 , 再称定重量 , 用甲醇补足减失的重量 , 摇匀 , 滤过 , 取续滤液 , 即得。
1. 2. 4阴性溶液的制备 取除制何首乌外的其他药材 , 制成样品 , 参照供试品溶液的制备方法 , 制得阴性溶液。
2结果
2. 1线性关系考察 分别精密吸取二苯乙烯苷对照品溶液(0.0998 mg/ml) 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 ml, 置 10 ml 量瓶中 , 加50% 甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 分别精密吸取各对照品溶液各20 μl, 注入液相色谱仪 , 测定峰面积。以进样量为横坐标 ,峰面积为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 其回归方程为 ：Y=69.8977X-9.9199,r=0.9999。结果表明,二苯乙烯苷浓度在4.99~29.94μg/ml范围内有良好的线性关系 , 见表 1。
2. 2提取溶媒选择 取供试品数份 , 精密称定 , 分别加入甲醇、乙醇、50% 甲醇、50% 乙醇 , 超声处理 30 min, 按高效液相色谱法测定。结果表明 , 采用上述四种溶剂提取 , 但以50% 甲醇提取含量最高 , 测得的峰形良好 , 分离度良好 , 干扰峰较小 , 故选择 50% 甲醇作为提取溶媒 , 见表 2。
2. 3提取方法及提取时间选择 取供试品数份 , 加入 50%甲醇 , 分别采用超声处理与加热回流 30 min 方式提取 , 按高效液相色谱法测定。结果表明 , 两种提取方法的提取效率相差不大 , 为方便起见 , 采用超声提取。分别采用不同提取时间及不同超声功率进行考察 , 见表 3, 表 4。
2. 4阴性对照试验 取对照品溶液、阴性溶液及供试品溶液 , 注入色谱仪测定。结果表明 , 阴性溶液与对照品色谱相同保留时间处无色谱峰 , 供试品在对应位置色谱峰与相临峰分离度符合要求 , 峰形好 , 故阴性无干扰。
2. 5精密度试验 精密称取供试品适量 , 按“供试品溶液的制备”项下方法制备 , 重复进样 5 次 , 测定峰面积 , 见表 5,RSD% 为 0.40%, 可见仪器精密度良好。
2. 6稳定性试验 精密称取供试品 , 按“供试品溶液的制备”项下制备 , 分别于第 0、4、8、12、16、20 小时进样测定 ,结果表明供试品溶液在 20 h 内基本稳定 , 见表 6。
2. 7重复性试验 精密称供试品 , 按“供试品溶液的制备”项下制备 , 依法测定 , 结果其含量平均值为 4.83 mg/g,RSD=1.6%, 表明此方法重复性良好 , 见表 7。
2. 8回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品 ( 批号 ：20050511) 约 0.1 g, 分别精密加入二苯乙烯苷对照品溶液(0.486 mg/ml) 1.0 ml, 按“供试品溶液的制备”方法制备 , 依法测定 , 按下式计算回收率 , 见表 8。
3样品测定
取三批中试样品 , 按含量测定方法 , 依法测定 , 见表 9。根据以上测定结果,暂定本品每袋含二苯乙烯苷(C20H22O9)应不得少于 12.5 mg。
4讨论
4. 1样品提取条件的选择在研究过程中分别进行了不同溶剂 ( 甲醇、50% 甲醇、50% 乙醇 )、不同提取方法 ( 超声处理、回流提取 ) 和不同提取时间 (20、30、40 min) 的比较 , 最后确定以 50% 甲醇超声处理 30 min 为最佳。
4. 2本试验的二苯乙烯苷含量测定的色谱条件 , 能使二苯乙烯苷与其他组分达到较好的分离 , 线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率数据均符合定量要求 , 可作为六味首乌颗粒质量标准中二苯乙烯苷含量测定的测定方法。
综上所述 , 该测定方法操作简便、结果准确、重现性好 ,可用于六味首乌颗粒的质量控制。
