七味红花殊胜丸是由红花、天竺黄、獐牙菜、诃子、麻黄、木香马兜铃、五脉绿绒蒿 7 味药物组成的藏成药,清热消炎,保肝退黄,用于新旧肝病、劳伤引起的肝血增盛、肝肿大、巩膜黄染、食欲不振治疗.由于该制剂在《青海省藏药标准(1992 年版)》中只有性状检验,而对主药红花[2]无任何定性定量分析标准,在临床使用及药品质量控制方面存在局限性.为了有效地控制产品质量,笔者采用薄层色谱(TLC)法对本品中的红花进行了定性鉴别,同时采用高效液相色谱(HPLC)法对制剂中红花的主要有效成分羟基红花黄色素 A 进行含量测定.
1 仪器与试药
AgiIent 1260 型高效液相色谱仪,G1314F VWD 检测器;LC 化学工作站(美国安捷伦公司);TD10002B 电子分析天平(余姚市金诺天平仪器有限公司);超声波清洗器(DS10260D,天津市康科科技有限公司).
红花对照药材(批号:121009-200506)、羟基红花黄色素 A对照品(批号:0757-200206,含量测定用)均由中国药品生物制品检定所购进;七味红花殊胜丸(青海省海北州藏医院制剂,批号 20121019、20130816、20140318,丸重 0.3g);硅胶 H 薄层板(青岛海洋化工厂分厂);甲醇和乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水.
2 方法与结果
2.1 红花的 TLC 鉴别:取本品粉末 5g,加 80%丙酮溶液 10ml,密塞,振摇 15min,静置,取上清液作为供试品溶液;另依照七味红花殊胜丸的配方,除去红花,同法制备阴性对照溶液;另取红花对照药材 0.5g,同法制成对照药材溶液.吸取上述两种溶液各3μL,分别点于同一硅胶 H 薄层板上,以乙酸乙酯∶甲酸∶水∶甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂,展开,取出,晾干.供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;阴性对照无干扰.红花的 TLC 见图 1.
2.2 含量测定2.2.1 色谱条件:色谱柱 EcIiPse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇∶乙腈∶0.7%磷酸溶液(26∶2∶72);流速:1.0ml·min^-1;检测波长:403nm;柱温 30℃;进样体积 10μL;理论板数按羟基红花黄色素 A 峰计算应不低于 3000;高效液相色谱见图 2.
2.2.2 对照品溶液的制备:取羟基红花黄色素 A 对照品 6.59mg,精密称定,置 50ml 量瓶中,加 25%甲醇制成每 1ml 含 0.1318mg·ml^-1的对照品溶液,摇匀,即得.
2.2.3 供试品溶液与阴性对照溶液的制备:取本品粉末 1g,精密称定,置 250ml 具塞锥形瓶中,精密加入 25%甲醇 50ml,称定重量,超声处理(功率 300W 频率 50kHz)40min,放冷,再称定重量,用 25%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得.另依本品配方,除去红花,同法制备阴性对照溶液.
2.2.4 线性关系考察:精密量取对照品溶液 1、2、3、4、5、6ml,分别置 10ml 量瓶中,加 25%甲醇至刻度,摇匀,得浓度为 13.18、26.36、39.54、52.72、65.90、79.10μg·ml^-1系列对照品溶液,按"2.2.1"项下色谱条件测定,记录峰面积.以峰面积(Y)为纵坐标,进样浓度(X)为横坐标,制备标准曲线,得回归方程为 Y=29.711Х+15.251,r=0.9998(n=6),结果,羟基红花黄色素 A 在13.18~79.10μg·ml-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系.
2.2.5 精密度试验:取对照品溶液适量,重复进样 6 次,测定羟基红花黄色素 A 的峰面积.结果 RSD=0.56%(n=6),表明仪器精密度良好.
2.2.6 重复性试验:取同一批号样品(20140318)6 份,按"2.2.3"项下方法制成供试品溶液,在上述色谱条件下测定、计算.结果RSD=0.63%(n=6),表明本方法的重复性良好.
2.2.7 稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液,在上述色谱条件下分别于 0、2、4、8、12、24h 进样 10μL,测定.结果 RSD=1.14%(n=5),表明供试品溶液在 24h 内稳定.
2.2.8 加样回收率试验:取已知含量的同一批样品 6 份,精密称定,分别精密加入羟基红花黄色素 A(浓度为 0.1318mg·ml^-1)对照品溶液 5ml,按"2.2.3"项下方法制备供试品溶液,再按"2.2.1"项下色谱条件测定,计算回收率.结果,羟基红花黄色素 A 的平均加样回收率为 98.2%,RSD=1.27%(n=6).
2.2.9 干扰试验:精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各 10μL,分别注入液相色谱仪.结果,供试品色谱图中,在与对照品色谱峰保留时间位置有相应的色谱峰;阴性对照色谱图中,对照品色谱峰相应保留时间位置上无色谱峰,表明七味红花殊胜丸中其他组分对测定无干扰.
2.2.10 样品含量测定:取 3 批样品,按"2.2.3"项下方法制备供试品溶液,照"2.2.1"项下色谱条件进行测定,按外标法计算羟基红花黄色素 A 的含量,结果见表 1.
结合 2010 年版《中国药典》(一部)红花项下含量测定内容,制定本品含量限度为红花以羟基红花黄色素 A 计每丸应不少于 1.0mg.
3 讨 论
本试验根据 2010 年版《中国药典》(一部)规定,以甲醇∶乙腈∶0.4%磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相,用于羟基红花黄色素 A的测定,结果表明,色谱峰峰形好,与其他组分能达到基线分离,且分离度好;用 25%甲醇提取样品比较完全;提取时间分别考察了 30min、40min、60min,结果 40min 完全提取.
方中红花为主药,TLC 鉴别在试验过程中与对照药材显示相同的斑点,斑点清晰,Rf 值适中,且阴性对照无干扰,其定性鉴别方法简便、灵敏.
综上所述,采用 HPLC 法测定主药红花所含有效成分羟基红花黄色素 A 的含量,准确、简便、阴性无干扰,可作为该制剂的质量控制标准.
参考文献
[1]青海省藏药标准[S].1992 年版,青海省卫生厅.
[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S]:2010 年版,一部,北京:中国医药科技出版社,2010.
