摘要：银杏素有植物界的活化石之称，具有极高的药用价值。为培育高品质的银杏种质及阐明其药用成分的生物合成机制，有关银杏的转录组研究不断深入。综述近几年新出现并成功应用于植物转录组学研究的前沿技术，如单细胞转录组测序和空间转录组，并从前沿技术的视角对银杏转录组学的研究进行讨论与展望。
关键词：银杏； 转录组学； 单细胞转录组测序； 空间转录组； 综述；
Abstract:
Ginkgo has long been known as the living fossil of the plant kingdom, with great medicinal value. More and more transcriptome studies about Ginkgo are established to cultivate the Ginkgo germplasm with high quality and elucidate the biosynthesis mechanisms of its medicinal ingredients. Advanced technologies emerging in recent years and successfully applied in plant transcriptomics research are reviewed, such as single cell transcriptome sequencing and spatial transcriptome. And from the perspective of cutting-edge technology, the transcriptomics research of Ginkgo is discussed further with bright expectation.
Keyword:
Gingko biloba L.; transcriptomics; single cell transcriptome sequencing; spatial transcriptome; review
银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科银杏属落叶乔木。传统药方记载银杏的药用部位为叶片，多用于治疗哮喘和支气管炎。现代药理研究证明，银杏叶提取物还具有扩张血管、保护血管内皮组织、调节血脂、抑制血栓形成、清除自由基等功效[1],可用于脑卒中、冠状动脉硬化性心脏病稳定型心绞痛等常见疾病的治疗[2,3].银杏内酯和银杏黄酮是银杏叶及其提取物的主要药用成分。现行标准规定，银杏叶提取物中黄酮醇苷含量不少于24%、萜内酯含量不少于6%[4] .随着银杏叶制剂的广泛应用，如何培育优质的银杏种质以及银杏提取物的体外生物合成等问题受到关注。解决这些问题需要对银杏主要活性成分的合成通路以及关键的限速酶、基因功能进行全面解析。
转录组学已逐渐成为基因功能研究的重要手段之一[5,6,7].在过去的几十年里，RNA分析技术的不断发展也推动着生物学科的更新。目前，RNA转录可以对整个组织甚至是单个细胞进行识别和量化。银杏作为一种单科单属的高等植物，其细胞直径大于常见的草本植物，这导致部分研究方法存在技术屏障；且新型的转录组学研究方法一般先用于模式动植物的研究，因此有关银杏的转录组学研究还处于基础阶段[8,9,10].本文对新型的转录组学研究方法进行综述，并围绕银杏的转录组学研究进行讨论。
1 转录组学
基因组在生物体的生命历程中是相对稳定的，有限的突变可能是DNA复制过程中发生的错配或在某些试剂、辐射作用下造成的。与转录组相比，基因组总体呈现一个稳定的状态。而转录组是指针对特定生理或病理状况下特定类型的细胞或组织表达的所有种类的RNA及其功能。
转录组学的研究目的是解释某些关键基因的功能，确定基因表达量的变化[11,12,13].1977年，传统的Sanger测序法诞生，标志着基因测序技术成为可能，测序技术从表达序列标记、微阵列、二代测序发展到现在最新的三代测序[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24].三代测序技术可对RNA进行直接测序，这一优势不但为探索复杂的转录组提供了极大便利，也促进了单细胞转录组测序和空间转录组等新型研究方法的发展[25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36].
2 转录组学前沿研究方法
2.1 单细胞转录组测序
目前，利用测序技术对转录方向的研究已经不再局限于组织或器官层面。在多细胞生物中，单个细胞间的差异可能造成同种组织产生深远的功能差异，这为转录组信息提供了一个新的研究维度。单细胞RNA测序（scRNA-Seq）方法旨在从单个细胞层面揭示组织构成、转录动力学和基因之间的调控关系，并且有望重塑当前的细胞分类系统[37,38].
2009年，Tang等[39]研究者最先采用scRNA-Seq方法对小鼠囊胚的单个细胞进行无偏倚、高通量和高分辨率的转录分析。首先分离组织，然后分离并捕获单个细胞，每个捕获的细胞都以一个特定的寡核苷酸条形码进行标记，从而使来自不同细胞的RNA均可以从其他细胞中被识别；随后裂解细胞，再利用体外转录或聚合酶链反应进行逆转录，将扩增后的cDNA片段优化并连接到分子适配器，从而实现高通量测序；最后进行测序并计算分析，以获得细胞类型及其相关的转录组特征。需要注意的是，检测细胞的类型、所使用的捕获方法、文库构建和测序的选择、测序深度等均会对实验结果产生影响[40,41],因此，特定的实验流程需根据实验需求进行设定。
单细胞转录测序研究多集中于动物细胞及肿瘤疾病方面。利用不同的单细胞转录组测序方法可以鉴定细胞类型及其基因表达模式和细胞功能区域特异性[42,43].目前，对动物样本的单细胞转录组测序技术已较为成熟，但由于植物细胞具有细胞壁这一限制条件，要实现单细胞转录组测序还具有一定难度。华中农业大学严建兵团队对减数分裂后的四分体每个小孢子进行测序，实现了玉米的单细胞转录组测序[44].该实验在显微镜下借助玻璃微管系统手工分离同一发育四分体的4个微孢子；由于细胞内渗透压高，在分离过程中，将细胞浸于27%D-山梨醇溶液并反复吹打，以破坏细胞壁和四分体；后将4个独立的细胞放入PCR管进行裂解并测序。
随着技术的更新，Ryu等[45]采用10x Genomics技术（一个商用的基于液滴的微流体技术高通量scRNA-Seq平台）对超过10 000个拟南芥根细胞的原生质体进行单细胞转录组测序，进一步明确了不同亚群及罕见的细胞类型，集中阐述了根细胞转录组中单个细胞如何分生根毛以及相关细胞分化的发展轨迹。该研究不仅证明了scRNA-Seq在植物研究中的可行性和实用性，还获得了拟南芥单细胞分辨率的基因表达图谱。
2.2 空间转录组
进一步了解组织结构需要阐明细胞群和基因表达的空间关系。scRNA-Seq在一次实验中对成百上千个细胞进行测序，可无偏倚和系统地反映组织内的细胞群及其状态，但该技术并不能对组织中单个细胞的空间组织特征进行描述。空间转录组学技术为转录组学研究领域的新方向。St?hl等将小鼠大脑的组织切片置于载玻片上，使DNA链与内置的标签连接在一起，进而对活性基因产生的RNA分子进行标记，当进行组织内的RNA分析时，标签会指明RNA分子存在于组织的哪个部位。利用这个方法，他们又对人类乳腺癌样品进行分析，并证明该方法不仅能提供有关疾病异质性的诊断信息，而且能用于所有类型的组织和疾病[46].
与哺乳动物系统相比，植物组织和细胞存在许多特殊的结构和生理过程，包括植物细胞壁、液泡、叶绿体和次生代谢。这些差异特征使许多新型研究方法不能直接应用于植物领域，需要对物种或组织进行特定的优化。Giacomello等[47]对拟南芥、欧洲山杨和挪威云杉进行空间转录组实验，以验证该技术的可行性。实验结果表明，该技术在被子植物和裸子植物中均有良好的适用性。
然而，现有的空间基因表达图谱主要是通过原位杂交这种低通量方法创建的，该方法不仅颇为复杂，也限制了多样本评估。近年来，一些新方法为空间转录组研究提供了便捷，如高级多重荧光原位杂交、成像切片或三维组织的原位测序[48,49],这些研究手段在切片中定位RNA的一般工作流程如下。首先，设计目的基因的探针；其次，制备特殊的组织切片（通常小于20 μm），切片的制备是该技术的核心步骤，需在低温恒温器上进行，安装后置于低温中存放，玻片处理应注意避免探针的非特异性结合、组织脱水、探针杂交和扩增，以增加与杂交探针相关的信号；最后，通过显色或荧光检测扩增探针信号以显示基因表达。特别是前沿的单分子荧光原位杂交（single molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH）方法，其采用连续多轮杂交、检测和剥离的流程，可在同一组织切片内检测到数百或数千个基因表达目标。
目前空间转录技术多依赖于非线性的显色检测，通常从定性或半定量的角度进行分析，这掩盖了有关潜在RNA丰度的真实定量信息。对于新型的smFISH方法，其单个转录本可执行单分子定量，并映射到相应的宿主细胞。smFISH技术在基因表达靶点数量上的增长为全基因组检测RNA提供了可行性，但在实践中仍具有较高的操作难度，需要复杂的组织分离技术以及将基因表达投影到现有空间信息上的量化运算方法。
3 银杏的转录组学研究
转录组研究可以从整体水平掌握基因表达与调控规律，开展药用植物的转录组研究有助于揭示中药有效成分的形成机制，规范入药标准，并为其育种提供参考。银杏是一种非模式植物，其相关的基因研究曾一度停滞不前，随着RNA测序（RNA-Seq）技术的发展，现在银杏的基因研究尤其是基因转录方面研究已取得较大进步。
3.1 基础转录研究
张楠等[50]最早对银杏细胞的转录组进行高通量测序，挖掘银杏内酯及紫杉醇的生物合成基因，共得到32 032个基因片段（unigene）。通过注释与功能分析发现，66个属于CYP450基因家族，726个参与次生代谢物合成，其中与萜类合成相关的59个，与二萜合成相关的17个。此外，还从样本的叶、侧根、果实等其他组织中找到与银杏细胞CYP450同源的紫杉烷羟基化酶候选基因15个。
余洁等[51]对硒处理后的银杏进行测序分析，旨在挖掘银杏萜类合成的关键基因。研究得到6条与萜类合成密切相关的候选基因，但通过验证仅有DXS、MECT、HMGR这3条与转录组分析结果一致，说明仅靠数据库分析进行转录组研究还存在一定缺陷。
随后，Han等[52]对银杏的无菌苗进行RNA-Seq的转录组研究，生物信息分析共得到39 941个unigene,其中24 645个片段均可在数据库中得到注释，并找到一个新的黄酮生物合成关键酶基因GbCHI1.
路兆庚[53]采用高通量测序技术对银杏的叶片及胚珠进行数字基因表达谱分析，共获得77 898个unigene,进一步丰富了转录信息。基因定量结果显示，银杏的胚珠与叶片间存在42 149个共同表达基因，叶片和胚珠中分别有14 679和6 301个特有高表达基因，叶片中高表达基因编码的蛋白可能参与植物防御及光合作用，而胚珠中高表达基因编码的蛋白主要参与细胞壁合成、黄酮类物质合成及分泌。这项研究为银杏叶片和胚珠的各种生理代谢以及胚珠的发育机制研究提供了参考。
转录是一个动态过程。He等[54]选取不同发育时期的银杏果作为研究对象，通过测序研究银杏果在整个发育时期的转录变化，共得到68 547个unigene,整个发育过程中有3 869个基因的表达量发生明显变化。该研究详细讨论了相关基因的注释和表达情况，但并没有发现与黄酮合成相关的基因。刘伟等[55]对不同生长时期的银杏幼年树和成年树进行二代测序，分析银杏类黄酮物质合成的关键基因表达。研究发现，有关类黄酮合成的基因中肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、查耳酮合成酶（CHS）、花青素合成酶（ANS）、花青素还原酶（ANR）和类黄酮O-甲基转移酶（FOMT）基因的表达量较高，类黄酮3′-羟化酶（F3′H）、类黄酮3′，5′-羟化酶（F3′5′H）和黄酮醇合成酶（FLS）基因的表达量则相对较低，但欠缺类黄酮物质含量的数据结果以及验证实验。此外，Du等[56]尝试比较银杏不同性别嫩芽的转录组差异，从而找到决定银杏性别的关键基因。尽管该研究共得到108 307个unigene,且其中51 953个unigene可在各大数据库得到注释，但并没有找到有关性别的关键基因。
3.2 深层转录研究
Parveen通过挖掘公共的RNA-Seq数据集，首次发现了可能编码与银杏萜类化合物生物合成相关的酶预测转录本，包括假定的萜类合成酶GbTPS1和GbTPS2[57].缺乏高质量的基因组阻碍了有关银杏的转录组研究。2016年，Guan等[58]对银杏的全基因组进行测序，共获得10.61 Gb的测序数据。密码子的模式分析是了解植物进化和遗传机制的有效途径。但近几年对被子植物的研究较多，而对裸子植物的研究较少。He等[59]基于银杏的转录组RNA-Seq数据，从68 547个候选基因中筛选出17 579个长度超过300 bp的unigene.分析发现，以A/U结尾的密码子使用频率较高，从裸子植物到双子叶植物再到单子叶植物有明显的梯度变化。同时对差异表达的unigene分析表明，高表达的unigene倾向使用G/C结尾的密码子。而不同功能的unigene变化提示，参与环境适应的unigene使用G/C结尾的密码子频率更高。
银杏作为雌雄异株植物，在生长状态、生存习性等方面有很大差异。为探究性别与相关基因的关系，唐海霞等[60]利用RNA-Seq技术对来源于同一家系的25年生银杏雌、雄花芽及大、小孢子叶球进行转录测序，共得到60 Gb的高质量序列，拼装后得到108 307个unigene,平均长度796 bp.生物信息分析认为，转录因子PYL、SNRK2、EIN3以及编码甲基转移酶的基因MET1和COMT1等可能参与了银杏的性别决定过程。
蔡雨蒙等[61]为阐述银杏开花的调控机制，对不同时期的银杏叶片进行转录组测序，通过对比开花前后的差异表达基因，筛选出一个constans-like基因，对其cDNA进行克隆，得到完整的编码序列（GbCOL）。经深层次分析认为，该基因在银杏开花调控过程中发挥重要作用。同年该课题组通过鉴定银杏花芽分化的关键基因，揭示了银杏花芽分化的主要分子机制[62].收集银杏花芽3个不同分化时期（未分化期、分化始期、分化盛期）的RNA-seq数据，分析数字表达谱，筛选关键基因并验证，最终得到gene.Gb_17618、gene.Gb_19790、gene.Gb_16301、gene.Gb_28337、gene.Gb_01884、gene.Gb_41704这6个花芽分化的关键基因。
Li等[63]最近采用RNA-Seq技术研究银杏珠心细胞的程序性死亡基因调控。KEGG数据库分析表明，有72个差异基因涉及植物激素信号转导，99个差异基因参与珠心细胞的程序性死亡，并从程序性死亡前期、开始阶段和执行阶段分别进行阐述。
4 小结与展望
现阶段银杏的转录组研究多为测序后与各大数据库进行比对与注释，通过GO富集、KEGG富集等手段对所关注的编码基因进行基础分析，但银杏叶内生物合成与相关基因表达的关系、不同细胞的生物功能与相互作用、相关基因表达的空间变化及其生物表征等问题还需进一步深入探索。
已报道的有关银杏的转录组研究中，转录组与其他生物表征之间的对应关系均是通过间接方式获得的。无论是银杏的性别决定基因还是类黄酮成分的测序分析，均是对选定组织进行整体测序，再基于计算机软件筛选、分析关联基因。对实验结果的准确性以及是否存在假阳性无法进行客观判断，且很难实现对未知基因的探索。对于这种表征被"映射"到实验中而获得的结果，最常见的验证方法是对筛选的目的基因进行PCR检测，而空间转录组可以实现组织内目的基因表达量的可视化，具有较好的应用前景。
若能将scRNA-Seq技术应用于银杏转录组研究，有望从分子、细胞和功能特征三方面实现全方位研究。在分子水平，scRNA-Seq技术可以获得染色体、甲基化、蛋白质抗原表位等结构变化；在细胞水平，该技术可以获得细胞的形态学特性，进而获取细胞内容物进行测序；在功能特征方面，该技术不再关注细胞群的平均状态，而是获得某一类细胞的个性特征，结合蛋白互作分析可更准确地研究其功能变化。这些结果综合银杏的药理研究与单细胞表型差异，可解释银杏药用成分大多富集于银杏叶片的原因。同时，早期基因实时表达也可作为检测细胞活性的新型手段，阐述银杏叶特定细胞类型的功能活动与转录组属性。
空间转录组与单细胞转录组测序有助于解决现阶段面临的难题，scRNA-Seq和smFISH等前沿技术或将揭示银杏的新细胞类型、组织规则和功能特性。倘若将单细胞转录组测序获得的高分辨率数据与空间转录组可视化的基因表达相结合，或能产生更加直观且丰富的实验结果，这有助于理解转录组学的结果是如何反映组织内的生物合成，也为研究银杏酮酯在银杏叶内的生物合成提供一个新的思路。
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